謝守玉，劉惠心，周 媛，熊陳勇，施開創(chuàng)，屈素潔，蘇文廣，溫新瑞，李 媛，李春英，鄧桂潮，尹彥文*

(1.廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2.廣西大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；3.北海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 北海 536000； 4.欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 欽州 535099；5.浦北縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 欽州 535300)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus,ARV)宿主譜廣泛，不僅能感染雞、火雞、鴨、鵝等家禽類[1-4]，而且可以感染野鳥[5]，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。1950年，水禽源禽呼腸孤病毒(waterfowl-origin avian reovirus,WRV)在南非首次報(bào)道[6]。1972年，法國首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)典番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)[7]，隨后，歐洲多個(gè)國家相繼分離出MDRV毒株[8-10]。1997年，我國首次發(fā)現(xiàn)MDRV感染引發(fā)的疫情。MDRV主要感染3周齡內(nèi)的雛番鴨，可持續(xù)帶毒感染至6周齡，病死率為10%～30%[11]。2005年，我國東南沿海地區(qū)出現(xiàn)新型鴨呼腸孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)引發(fā)臨床上以肝臟不規(guī)則壞死及出血、脾臟嚴(yán)重腫大出血為特征的新發(fā)疫病，病死率為5%～50%，宿主譜比MDRV更為廣泛，如番鴨、半番鴨、麻鴨、雛鵝等均能感染[12]。NDRV感染可導(dǎo)致患病鴨免疫器官萎縮或壞死，成為嚴(yán)重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要免疫抑制性疫病[13]。近年來，NDRV感染呈逐年上升趨勢，已蔓延至全國養(yǎng)鴨主產(chǎn)地區(qū)，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。

NDRV為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬，分片段的雙股RNA病毒[14]。NDRV有10個(gè)RNA片段，大基因L1、L2、L3，分別編碼λ A、λ B、λ C 蛋白；中基因M1、M2、M3，分別編碼μ A、μ B、μ NS 蛋白；小基因S1、S2、S3和S4，分別編碼P10、P18、σ C、σ A、σ B和σ NS 蛋白[15]。近年來，廣東、福建、浙江、山東等地上傳了NDRV全基因組序列，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)國內(nèi)的NDRV分離株親緣性較近，但廣西地區(qū)的NDRV相關(guān)報(bào)道很少，廣西NDRV全基因組序列分子特征尚不明確。本研究從發(fā)病鴨的組織病料中鑒別診斷為NDRV陽性(命名為GX01-2020)，對其進(jìn)行全基因組測序，并與國內(nèi)外不同地區(qū)的NDRV、MDRV及CRV(chicken-origin avian reovirus)進(jìn)行序列比對，分析GX01-2020全基因組的核苷酸序列及氨基酸序列，以期為廣西地區(qū)NDRV的流行情況提供數(shù)據(jù)支持，為NDRV的有效防控和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑MiniBEST viral RNA/DNA Extraction Kit Ver 5.0(批號：AK2501)，PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(批號：ASF0454A)，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver 4.0(批號：AK11054A)，pMD18-T載體(批號：ASF1711A)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(批號：AK71029A)均購于TaKaRa公司。

1.2 病料檢測病料樣品來自2020年廣西北海某養(yǎng)鴨場發(fā)病的番鴨，采集肝臟、脾臟、腎臟、肺臟等組織樣品，放置含有適量PBS溶液(體積比4∶1，pH 7.2)的滅菌離心管中，經(jīng)組織研磨儀磨至糜狀，離心取上清用于總核酸提取，應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的特異性引物和TaqMan探針進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。上游引物：5′-GGGTCGCACTACAGAGCAACT-3′,下游引物：5′-CGCCTCATCATAGTAATCTGCAA-3′,探針：CY5-CTTGATCAATATGCCGTTGCTCTGCATG-BHQ3。反應(yīng)體系為20 μL：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL，特異性上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，探針(20 μmol/L)0.2 μL，模板3 μL，滅菌雙蒸水5.8 μL。反應(yīng)程序：95℃ 20 s；95℃ 5 s，58℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，同時(shí)收集熒光信號。結(jié)果判定：有擴(kuò)增曲線，且Ct值小于35則判為陽性；無擴(kuò)增曲線或Ct值大于35則判為陰性。

1.3 病毒全基因組擴(kuò)增測序以檢測結(jié)果為陽性的核酸為模板，應(yīng)用本研究設(shè)計(jì)的NDRV全基因組測序引物(表1)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。建立50 μL反應(yīng)體系：模板2 μL，PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL，2×One Step Buffer 25 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，無RNA酶滅菌水補(bǔ)足體系。反應(yīng)程序：50℃ 30 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 全基因組測序引物

PCR產(chǎn)物膠回收純化后，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送至測序公司測序，每個(gè)片段重復(fù)測序3次。使用DNAStar軟件包中的SeqMan對獲得的基因片段進(jìn)行序列拼接，最終得到GX01-2020全基因組序列。

1.4 NDRV全基因組序列分析將拼接后的10段核苷酸序列上傳至NCBI的BLAST中進(jìn)行比對，檢驗(yàn)相似性最高的毒株。應(yīng)用BioEdit軟件對GX01-2020及國內(nèi)外參考毒株(表2)基因組核苷酸序列及其氨基酸序列同源性進(jìn)行分析。應(yīng)用MEGA 7軟件對比對后的序列進(jìn)行最佳核苷酸替換模型計(jì)算：L1為GTR+G+I；L2，L3為GTR+G；M1為HKY+G+I；M2為K2+G+I；M3為GTR+I；σ A為K2+I；σ B，σ C為K2+G；σ NS為TN93+G+I。以最佳核苷酸替換模型為基礎(chǔ)，采用最大似然法(maximum likelihood)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值定義為1 000次。應(yīng)用RDP 4(recombination detection program 4)和SimPlot(ver 3.5.1)軟件進(jìn)行全基因組的重組分析，檢測是否有重組。

表2 NDRV主要參考毒株信息

2 結(jié)果

2.1 全基因組測序結(jié)果應(yīng)用SeqMan軟件將測序得到的片段進(jìn)行拼接，結(jié)果顯示，GX01-2020株全長為23 353 bp，共有10個(gè)基因組片段：L1(3 958 bp)，L2(3 830 bp)，L3(3 900 bp)，M1(2 284 bp)，M2(2 134 bp)，M3(1 996 bp)，S1(1 568 bp)，S2(1 290 bp)，S3(1 202 bp)，S4(1 191 bp)。應(yīng)用NCBI上的ORF預(yù)測結(jié)果顯示，有9個(gè)片段只編碼單個(gè)ORF，編碼的氨基酸大小為97～1 293 aa，而S1編碼3個(gè)相互有重疊區(qū)域的ORF，分別為p10(20～313 bp)、p18(273～761 bp)及σ C(571～1 536 bp)(表3)。

表3 GX01-2020株基因組結(jié)構(gòu)特征

2.2 全基因組核苷酸及氨基酸同源性分析應(yīng)用BioEdit軟件將廣西GX01-2020株與國內(nèi)外參考毒株全基因組核苷酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，10個(gè)片段的基因組序列與參考毒株的核苷酸序列同源性為42.1%～99.4%(表4)。其中，λ系列蛋白核苷酸序列與參考毒株的同源性為42.1%～98.6%，氨基酸序列同源性為15.5%～99.9%，核苷酸同源性最高的分別為廣東SH12株(98.0%)、廣西GX-Y7株(98.6%)及重慶SL株(98.2%)，氨基酸同源性最高的分別為廣東SH12株(99.9%)、河南HN5d株(99.7%)及山東DE150株(99.6%)。μ系列蛋白核苷酸序列與參考毒株的同源性為63.5%～98.7%，氨基酸序列同源性為77.2%～99.4%，核苷酸及氨基酸同源性最高的均為重慶SL株，同源性分別為97.7%和99.0%,98.4%和99.4%,98.7%和98.7%。σ系列蛋白核苷酸序列與參考毒株的同源性為21.2%～99.4%，氨基酸序列同源性為23.5%～99.7%，核苷酸及氨基酸同源性最高的分別為北京J18株(98.4%和99.7%)、廣西GX-Y7株(99.4%和99.7%)、廣東SH12株(97.9%和97.8%)及重慶SL株(99.3%和99.4%)。

2.3 遺傳進(jìn)化分析對GX01-2020株及參考毒株的10個(gè)全基因組片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，結(jié)果顯示，10個(gè)片段的核苷酸遺傳進(jìn)化樹基本相似，以GX01-2020、廣西GX-Y7株與國內(nèi)外的NDRV代表毒株為一個(gè)進(jìn)化分支，以經(jīng)典MDRV和CRV為另外兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。但也有不同，如L2、L3的進(jìn)化樹中，MDRV代表毒株組成兩個(gè)不同方向的進(jìn)化分支；σ A的進(jìn)化樹中NDRV分成兩個(gè)進(jìn)化分支，其中上海TH11株、福建NP03株及山東SD-12株與國內(nèi)的MDRV參考毒株組成一個(gè)分支，而GX01-2020株、廣西GX-Y7株及其他NDRV參考毒株與法國MDRV毒株組成另一個(gè)分支。此外，遺傳距離也有不同。M2片段進(jìn)化樹中，NDRV與CRV遺傳關(guān)系較近，而其他片段進(jìn)化樹中NDRV則與MDRV較近；σ A系統(tǒng)發(fā)育樹中，上海TH11株、福建NP03株及山東SD-12株與國內(nèi)的MDRV參考株遺傳關(guān)系較近，而GX01-2020株、廣西GX-Y7株等其他NDRV毒株與法國2個(gè)MDRV毒株關(guān)系較近。

2.4 重組分析應(yīng)用RDP4和SimPlot軟件對GX01-2020株的10個(gè)基因組片段與參考毒株的基因組核苷酸序列進(jìn)行重組分析。結(jié)果，SimPlot軟件檢測到GX01-2020株的L1片段存在重組信號，重組親本為北京J18株和福建NP03株(圖2A)。RDP4軟件檢測到北京J18株的L1片段和廣東SH12株的L2片段有重組信號，重組親本分別為廣東SH12株與福建NP03株，山東SD-12株與廣東DH13株，但SimPlot未檢測出重組的具體位點(diǎn)。此外，浙江ZJ2000M株的S1片段在RDP4和SimPlot中均有重組信號，重組親本為北京815-12株與法國D1546株(圖2B)。

A.GX01-2020,MDRV_J18和DRV_NP03/CHN/2009的L1片段重組分析;B.MDRV_ZJ2000M,MDRV_815-12和MDRV_D1546的S1片段重組分析

3 討論

廣西屬于亞熱帶氣候邊境地區(qū)，為野鳥遷徙過冬常駐區(qū)域，加強(qiáng)邊境地區(qū)水禽源ARV流行病學(xué)調(diào)查及分子流行病學(xué)研究至關(guān)重要。本研究采集的病料源自廣西北海的番鴨養(yǎng)殖場，解剖發(fā)現(xiàn)典型的病理變化為肝臟腫大壞死、脾臟嚴(yán)重腫大充血，呈“櫻桃”狀。通過自主設(shè)計(jì)的特異性引物及探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分子診斷，檢測結(jié)果為NDRV陽性，而經(jīng)典MDRV、AIV、NDV、DTMUV、MDPV、GPV等病原核酸檢測結(jié)果均為陰性。經(jīng)全基因組序列測序發(fā)現(xiàn)，GX01-2020株共有10個(gè)基因組片段：L1～L3、M1～M3、S1～S4。基因組核苷酸序列分析顯示，除S1片段外，其他基因組片段大小同WRV和CRV相似。ORF預(yù)測表明GX01-2020株除S1外的片段為單順反子結(jié)構(gòu)，只編碼單個(gè)ORF，而S1片段為多順反子結(jié)構(gòu)，編碼3個(gè)部分重疊區(qū)域的ORF。這與CRV類似，但與WRV不同[16-18]。表明，GX01-2020株為不同于MDRV的NDRV。

核苷酸序列同源性分析結(jié)果顯示，L級片段中λ A核苷酸序列同源性最高的為廣東SH12株，該毒株為ZHANG等[19]2012年從廣東省的雛番鴨組織中分離到的NDRV毒株；λ B核苷酸序列同源性最高的是廣西GX-Y7株，這是基因庫上來源廣西地區(qū)NDRV毒株；λ C核苷酸同源性最高的為重慶SL株。表明，L基因組片段不完全具有地域遺傳特征。本研究中GX01-2020株L組片段核苷酸序列與NDRV代表株的同源性均在92.5%以上，這與部分學(xué)者研究結(jié)果一致[20-22]。此外，發(fā)現(xiàn)GX01-2020株L組片段核苷酸及氨基酸序列同源性最低的均為CRV(法國2株MDRV除外)，推測可能的原因是該組片段序列來源于CRV幾率較低，主要來源于WRV的重排。M級基因組片段核苷酸同源性最高的均為重慶SL株，為98%左右。此外，μ B核苷酸及氨基酸序列同源性最低的毒株均為經(jīng)典MDRV，而μ A、μ NS片段的則是CRV，這從遺傳進(jìn)化樹上也能得出相似結(jié)論。表明，M級基因組序列的來源祖先不同。S級片段編碼的σ系列蛋白中，σ A核苷酸同源性最低的為MW9710株(21.2%)，這是1997年從福建的番鴨分離到的MDRV，由于該片段不完整，僅有300 bp，故導(dǎo)致同源性低于CRV毒株。σ C蛋白在病毒感染早期階段起關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)病毒粒子與宿主細(xì)胞間相互作用及誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體[23-24]。此外，對σ C蛋白的核苷酸序列比對分析，通常是作為ARV毒株鑒定與分類的遺傳標(biāo)簽[25-28]。本研究中，GX01-2020株σ C核苷酸序列與NDRV代表株同源性為89.1%～97.9%，遠(yuǎn)高于MDRV的41.5%～43.0%和CRV的36.2%～39.2%，再次印證GX01-2020株為NDRV毒株。另外，通過核苷酸及氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，同源性最低的毒株均為CRV，表明σ級序列來源WRV的幾率要大于CRV。以上結(jié)果表明，GX01-2020株全基因序列與NDRV流行毒株有高度的同源性，具有遺傳多樣性的分子特征。

本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中，基于10個(gè)全基因組片段核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹基本按ARV種類分化，即NDRV、經(jīng)典MDRV與CRV組成3個(gè)不同的進(jìn)化分支。但L2、L3、σ A的進(jìn)化樹中，MDRV的代表毒株形成2個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，而其他片段的進(jìn)化樹中MDRV參考毒株組成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支。其中，來自法國的MDRV毒株D1546和D2044組成一個(gè)分支，來自國內(nèi)的MDRV毒株組成另一個(gè)分支。這與GX01-2020株核苷酸同源性分析結(jié)果一致，L2、L3片段與法國MDRV毒株同源性顯著低于其他MDRV代表毒株。此外，σ A進(jìn)化樹中，NDRV毒株分成2個(gè)進(jìn)化分支，一支是由TH11、NP03、SD-12與MDRV毒株ZJ2000M、815-12、MW9710組成；另一支是GX01-2020、GX-Y7等NDRV毒株與法國MDRV毒株組成，這與σ A同源性分析結(jié)果相符合。另外，在遺傳距離方面，NDRV的M2片段與CRV較近，與MDRV較遠(yuǎn)，這與其他片段不同，表明核苷酸序列來源祖先可能不同。以上結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)論相似[19,29-31]。最后，CRV參考毒株來源地有加拿大、美國、匈牙利、韓國和中國，10個(gè)片段系統(tǒng)發(fā)育樹中，CRV毒株均在同一個(gè)進(jìn)化分支，表明不同地域的毒株并未呈現(xiàn)不同的進(jìn)化趨勢，參考毒株沒有明顯的地域性遺傳特征。

重組分析發(fā)現(xiàn)GX01-2020株與北京J18株的L1片段檢測到重組信號，這與WANG 等[30]研究結(jié)果一致。ZHANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)J18株的M2片段，廣東SH12株及DH13株的S2片段均存在重組現(xiàn)象，但本研究并未檢測到該片段的重組信號。此外，本研究中廣東SH12株的L2片段和浙江ZJ2000M株的S1片段均檢測到重組信號，其親本毒株均為同種屬的病毒，但ZHANG等[19]并未有相關(guān)報(bào)道。表明，目前重組只發(fā)生在NDRV之間及MDRV內(nèi)部，并未發(fā)現(xiàn)NDRV、MDRV與CRV毒株相互之間有重組現(xiàn)象。但隨著病毒自身的不斷演化，宿主免疫系統(tǒng)的壓力及外部環(huán)境因素的影響等綜合因素作用下，這種情況也許會發(fā)生。因此，需密切關(guān)注ARV，尤其是對新型NDRV的分子流行病學(xué)研究將為該病毒引發(fā)疫病的有效防控奠定基礎(chǔ)。