曹龍龍，孟凡亮，焦秋林， 李 焱， 姜子昕，劉蒙達(dá)， 劉思當(dāng)*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018;2.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032)

腹瀉是仔豬最常見的一類疾病，其中以豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)最為重要。PED是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的一種豬高度接觸性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉、消瘦以及脫水為基本特征[1-2]，并有較高的病死率。PEDV為冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬成員，屬線性單股正鏈RNA病毒，其參考毒株為CV777[3]。該病毒全基因組長28 kb，包含編碼復(fù)制酶(Rep)、纖突糖蛋白(S)、基質(zhì)蛋白(M)、囊膜蛋白(E)、核蛋白(N)和ORF3等6個(gè)基因，按照5-Rep-S-ORF3-E-N-3順序排列[4]。其中核酸高突變區(qū)主要是位于S基因，其由1 387個(gè)氨基酸組成。S基因表面抗原決定簇決定病毒毒力，且能與細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞膜的融合，產(chǎn)生中和免疫反應(yīng)[5]。因此，S基因不僅在疫苗研發(fā)生產(chǎn)上具有重要意義，而且也是病毒變異分析的主要基因[6]。

自1971年首次在英國暴發(fā)PED后，該病很快蔓延至整個(gè)歐洲，隨后向其他地區(qū)擴(kuò)散[7]。20世紀(jì)80年代初中國就陸續(xù)有PEDV感染的報(bào)道，自2010年秋末開始該病毒的致病性顯著增強(qiáng)，在中國呈全國性大流行[8-10]。由PEDV造成的病毒性腹瀉發(fā)病率明顯高于歐洲和其他地區(qū)，研究證實(shí)流行毒株發(fā)生了變異且毒力顯著增強(qiáng)(vPEDV)。目前vPEDV在中國仍廣為流行，PED仍是威脅中國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，給中國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。為了解山東省近年來仔豬腹瀉相關(guān)病毒的感染狀況及發(fā)病規(guī)律，對(duì)2016-2019年間山東省部分地區(qū)仔豬腹瀉臨床病例進(jìn)行了調(diào)查分析，剖檢并采集了231份腹瀉仔豬的腸道與糞便樣品，進(jìn)行了腹瀉相關(guān)病毒感染檢測(cè)以及PEDV的S基因序列分析，為vPEDV的疫苗研發(fā)及腹瀉病綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料Viral RNA/DNA提取試劑盒和pMD18-T載體購自TaKaRa Biomedical Technology；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自羅氏公司；2×PCR Mix購自廣州東盛生物科技有限公司；AXYGEN膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司；鏈霉素、青霉素、胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 臨床樣品采集與處理2016年6月至2019年3月，主要從山東省泰安、菏澤、濟(jì)寧、棗莊等16個(gè)地市的126個(gè)豬場(chǎng)搜集疑似PED臨床病例231份，剖檢病死豬采集胃、腸道、淋巴結(jié)、糞便等病料。絕大多數(shù)豬場(chǎng)均進(jìn)行過PEDV疫苗CV777株接種，發(fā)病豬群主要表現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、水樣腹瀉、體質(zhì)量減輕和脫水，并有較高的病死率。病死豬剖檢主要表現(xiàn)為小腸壁變薄呈透明狀，腸腔內(nèi)有黃白色漿液樣內(nèi)容物，小腸黏膜有不同程度的充血或者出血，空腸系膜淋巴結(jié)充血腫脹等。取胃、腸、淋巴結(jié)等器官組織一部分固定用以制作石蠟切片；一部分加入無菌PBS(1 mL/g)，置于高通量組織研磨器中研磨，將研磨液經(jīng)12 000 r/min，4℃離心15 min后，進(jìn)行RT-PCR初步檢測(cè)，取上清液經(jīng)直徑0.22 μm濾器過濾然后分裝，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原鑒定將凍存的研磨液上清提取核酸，根據(jù)不同引物(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增鑒定。

表1 病原檢測(cè)引物序列

1.4 S基因的序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析按照AXYGEN膠回收試劑盒步驟進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收純化，回收產(chǎn)物通過與pMD18-T載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化后，由上海生工有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用Medlign、Mega X等軟件與GenBank中登陸的PEDV參考株序列(表2)進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列、抗原表位結(jié)構(gòu)域和抗原表位等的分析。

表2 PEDV S 基因參考株信息

2 結(jié)果

2.1 仔豬腹瀉病料病毒檢測(cè)結(jié)果采用PCR/RT-PCR方法對(duì)231份腹瀉樣品進(jìn)行病原檢測(cè)。231份仔豬腹瀉樣品中PEDV檢出率為63.20%(146/231)，其次為PCV2，檢出率為16.88%(39/231)，PoRV檢出率為5.19%(12/231)，TGEV檢出率為0.43%(1/231)，混合感染率為0.43%(1/231)，為PEDV和TGEV感染。結(jié)果表明山東省仔豬腹瀉主要源于PEDV感染，其次PCV2感染所致的腸炎也是造成仔豬腹瀉的重要原因之一。

2.2 典型病例病理學(xué)觀察結(jié)果病死豬嚴(yán)重脫水，消瘦，眼球深陷，股內(nèi)側(cè)灰綠色糞便污染(圖1A)。剖檢病死豬可見胃擴(kuò)張，充滿白色或黃色凝乳樣內(nèi)容物，胃黏膜不同程度的充血、出血，小腸壁變薄呈透明狀，腸腔內(nèi)灰白色或者黃白色漿液樣亦或者水樣內(nèi)容物(圖1B)，小腸黏膜有不同程度的充血或者出血，空腸系膜淋巴結(jié)充血腫脹(圖1C)；部分病豬腎臟表面可見散在的點(diǎn)狀出血。鏡檢病變主要表現(xiàn)胃腸黏膜呈急性卡他性或出血性卡他性炎癥，以空腸病變最為嚴(yán)重，小腸絨毛縮短，黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，黏膜固有層充血、出血(圖1D～H)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)在小腸黏膜上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見病毒陽性顆粒，其他組織病毒陽性顆粒較少。

A.病死豬嚴(yán)重脫水，消瘦，眼球深陷；B.小腸壁變薄呈透明狀，腸腔內(nèi)有黃白色漿液樣內(nèi)容物；C.小腸黏膜有不同程度的充血或者出血，空腸系膜淋巴結(jié)充血腫脹；D.腸絨毛縮短，100×；E.黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，固有層充血出血(200×)；F.腸絨毛萎縮，黏膜固有層充血(100×)；G.黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，固有層血管充血(200×)；H.黏膜下層充血、水腫(100×)；I.黏膜上皮細(xì)胞PEDV免疫組化染色陽性(200×)

2.3 PEDV S基因同源性分析通過分段測(cè)序并拼接，共獲得7株來自山東不同地區(qū)的PEDV S基因的全基因序列(表3)。將分離株核苷酸和氨基酸序列與從GenBank中登陸的22株國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行了同源性分析比較(表4)。結(jié)果表明，7株本研究分離株間核苷酸和氨基酸同源性分別為96.8%～100.0%和95.9%～100.0%，與疫苗株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.3%～93.6%和91.8%～92.8%。

表3 本研究中 PEDV 流行株樣品信息

表4 PEDV-S基因同源性比較 %

2.4 PEDV S基因核苷酸突變分析將7株P(guān)EDV分離株與中國現(xiàn)在使用的疫苗株CV777進(jìn)行了分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株與疫苗株CV777均存在著不同程度的堿基突變現(xiàn)象，并且均有不同位點(diǎn)的堿基缺失與插入現(xiàn)象。分離株在167 bp有1個(gè)堿基插入，175～180 bp有5個(gè)堿基插入，181～187 bp 有6個(gè)堿基插入，413～417 bp有3個(gè)堿基插入;在218 bp有1個(gè)堿基缺失，470～473 bp有3個(gè)堿基插入，474～480 bp有6個(gè)堿基缺失(圖2)，表明本研究分離株與疫苗株相比已發(fā)生變異。

圖2 PEDV S基因核苷酸分析比較

2.5 PEDV S基因氨基酸序列、抗原表位域及抗原表位突變分析將7株P(guān)EDV分離株氨基酸序列與疫苗株CV777進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株分離株均存在氨基酸突變，在aa59～aa62位有連續(xù)4個(gè)氨基酸(QGVN)插入，aa140有1個(gè)氨基酸(N)插入，而在aa160有1個(gè)氨基酸(G)的缺失。

將7株P(guān)EDV分離株S蛋白上誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的抗原表位域(COE：aa499-aa638)及抗原表位(S1D5：PVLVYSNIGVCKSGSI，S1D6：SGSIGYVPSQSGQVKI)與CV777的S蛋白上對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，7株分離株的COE序列沒有氨基酸插入及缺失，但是均存在氨基酸位點(diǎn)突變，其中所有毒株共同存在4個(gè)位點(diǎn)突變，分別是A521S→，T553S→，G598S→，Q637E→，其余個(gè)別毒株存在不同的位點(diǎn)突變。S1D5表位中7株分離株完全保守，沒有突變現(xiàn)象；S1D6表位存在兩處共同突變位點(diǎn)(L768S→，D770S→) (圖3)。結(jié)果表明，本研究分離株與疫苗株間氨基酸已存在大量突變，現(xiàn)有疫苗保護(hù)效果較差。

圖3 PEDV S基因氨基酸分析與抗原表位域及抗原表位分析比較

2.6 PEDV S基因遺傳進(jìn)化分析將7株P(guān)EDV分離株的S基因核苷酸序列與GenBank中登陸的22株國內(nèi)外參考株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。本研究分離株與參考株可分為GroupⅠ、GroupⅡ兩大群，7株分離株均屬于GroupⅠ，CV777、DR13和L00799-K11等參考株構(gòu)成獨(dú)立組群GroupⅡ組，其中SDXT、SDYT、SDLW、SDWF、SDTA和SDRZ位于同一大分支，與山東參考株SD2014、河南參考株CH-HNLH-2015和蘭州參考株CH-SXXY-2017等國內(nèi)參考株親緣關(guān)系較近，與墨西哥參考株MEX104、美國參考株USA-Colorado和哥倫比亞參考株COL-Cundinamarca屬于同一組群，有一定的親緣關(guān)系。而所有分離株與疫苗株CV777親緣關(guān)系均最遠(yuǎn)。結(jié)果表明山東地區(qū)當(dāng)前PEDV流行株與疫苗株遺傳距離遠(yuǎn)，差異較大。

3 討論

近年來，PED一直是影響中國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，給中國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。1995年起，中國先后使用了豬傳染性胃腸炎、PED二聯(lián)活苗和滅活苗，使免疫豬群得到了較好的保護(hù)[13-15]。然而自2006年以來，PEDV開始在中國免疫豬群中再度流行，尤其是自2010 年秋冬季節(jié)開始，該病形成變異株vPEDV，流行更加嚴(yán)重[15]。盡管目前中國山東省豬場(chǎng)采用了最新的豬傳染性胃腸炎、PD和豬輪狀病毒三聯(lián)苗，但腹瀉病情并沒有得到有效的控制[16-17]。本研究收集的231份仔豬腹瀉病料病原檢測(cè)結(jié)果中，vPEDV感染而致病的比例最高(63.20%)，其次為PCV2 (16.88%)。由此可見山東省仔豬腹瀉主要源于vPEDV感染，其次PCV2感染所致的腸炎也是造成仔豬腹瀉的重要原因之一。

▲為本研究分離株；◆為疫苗株

本研究結(jié)果分析表明，PEDV仍是山東省仔豬腹瀉的最主要病原，7株分離株S基因存在堿基的突變、插入和缺失，所編碼的蛋白發(fā)生變異，分離株與PEDV參考菌株具有93.1%～98.9%的核苷酸和91.5%～98.7%的氨基酸同源性，與疫苗株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.3%～93.6%和91.8%～92.8%，低于山東地區(qū)2014-2015年P(guān)EDV分離株S基因與CV777疫苗株同源性對(duì)比的93.5%～93.9%和92.2%～92.5%[17]，且與現(xiàn)有的CV777疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)同源性較低。當(dāng)前山東省PEDV流行株存在明顯變異，這是PED在免疫豬群中廣為流行的主要原因。由此可見當(dāng)前的疫苗免疫并不能完全保護(hù)豬群免受PEDV的攻擊。因此，使用流行株作為疫苗株可能會(huì)有更好的保護(hù)力，取得更理想的免疫效果，使豬群免受PEDV的攻擊。