劇 一，賴?yán)^超，薛偉彩

1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院(河北 邯鄲 056038) 2.河北中醫(yī)學(xué)院(河北 石家莊 050200) 3.河北省中醫(yī)院肛腸外科(河北 石家莊 050013)

近年來，隨著人們飲食習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈上升趨勢[1]。目前結(jié)直腸癌的治療多采取以手術(shù)、放化療等為主的綜合治療，但是化療藥物療效差、毒副作用較大，治療效果不理想，隨著分子腫瘤學(xué)的快速發(fā)展，如今腫瘤的靶向治療越來越得到人們的重視[2]。靶向治療技術(shù)在多種腫瘤治療上已經(jīng)取得了較大的進步，研究表明異常激活組織中某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將會引起腫瘤的發(fā)生，Hedgehog(Hh)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，Gli參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制涉及多種途徑中的靶基因表達來誘導(dǎo)，通過其轉(zhuǎn)錄激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，涉及腫瘤包括頭頸癌、肺癌、乳腺癌等[3-4]。針對既往結(jié)腸腺癌靶向治療研究不多，本研究通過在結(jié)腸腺癌LOVO細胞中Gli1和Gli2被抑制劑GANT61處理后的表達情況來探討其作用機制，旨在為臨床結(jié)腸腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料GANT61購自德國Merck公司，人結(jié)腸腺癌細胞系LOVO購自APTT細胞庫，胎牛血清購自Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液購自邁新公司，蛋白分析試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，Gli1兔抗人多克隆抗體、Gli2鼠抗人單克隆抗體、Fas鼠抗人單克隆抗體、GAPDH鼠抗人單克隆抗體、Bcl-2鼠抗人單克隆抗體和Caspase-3兔抗人單克隆抗體及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自邁新科技。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 于10%胎牛血清和青-鏈霉素各100 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)結(jié)腸腺癌LOVO細胞。

1.2.2 凋亡相關(guān)蛋白采用Western blot方法進行檢測 將細胞轉(zhuǎn)染48 h后取出，PBS洗滌細胞3次；加蛋白提取液和蛋白酶抑制劑，將提取液放置于4℃離心機中以12 000 rpm離心20 min。取離心后的上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，標(biāo)明分組；使用BCA試劑盒檢測，一抗Gli1(1∶1 000)、一抗Gli2(1∶250)、一抗Fas(1∶250)、一抗Bcl-2(1∶250)，一抗GAPDH(1∶10 000)，4 ℃搖床孵育過夜，每次10 mL分別加入羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶20 000)，ECL試劑發(fā)光后暗室曝光顯影，Image軟件檢測蛋白條帶的表達，實驗重復(fù)3次[5-6]。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將細胞培養(yǎng)于25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，待其生長良好后，更換培養(yǎng)液，加入不同濃度的GANGT61(10、20 μmol/L)作用LOVO細胞，同時設(shè)立對照組(不加GANT61)，PBS液洗滌，固定，PI染色，流式細胞儀測定熒光強度，應(yīng)用Expo32ADC進行數(shù)據(jù)分析，計算細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞Fas、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達 將細胞置入2%胎牛血清的培養(yǎng)基中，分別加入不同濃度的GANT61(0、10、20 μmol/L)作用LOVO細胞24 h，PBS洗滌細胞2次，調(diào)整每份樣品細胞數(shù)為1×106個/mL，每份樣品中分別加入鼠抗人Fas、Bcl-2和兔抗人Caspase-3抗體，PBS洗滌2次，再分別加入二抗，常溫靜置30 min，用PBS洗滌2次，流式細胞儀檢測其蛋白含量，平均熒光強度來表示蛋白量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1Westernblot檢測結(jié)腸癌細胞LOVO中蛋白表達與對照組比較，GANT61可以下調(diào)LOVO細胞Gli1(F=509.791，P=0.000)、Gli2(F=475.072，P=0.000)和Bcl-2(F=534.335，P=0.000)蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；增加Fas蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9 433.507，P=0.000)，且具有劑量依賴性，見圖1。

注：與DMSO組比較，*：P<0.01。

2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡不同濃度GANT61作用于LOVO細胞后凋亡率3組間比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(F=960.768，P=0.000),20 μmol/L GANT61作用于LOVO細胞24 h后細胞凋亡率(25.01±0.64)%，10 μmol/LGANT61作用組細胞凋亡率(15.62±0.59)%，兩組比較差異顯著(q=27.359,P<0.01)，20 μmol/L GANT61作用組細胞凋亡率(25.01±0.64)%與0 μmol/LGANT61作用組細胞凋亡率(3.78±0.55)%，兩組比較差異顯著(q=61.855，P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用組細胞凋亡率與0 μmol/LGANT61作用組比較差異顯著(q=11.840，P<0.01)，見圖2。

注：與DMSO組比較，*：P<0.01。

2.3流式細胞術(shù)檢測結(jié)腸癌LOVO細胞Fas、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平GANT61可以劑量依賴性下調(diào)LOVO細胞中Bcl-2蛋白表達水平，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.624,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用組Bcl-2低于0 μmol/LGANT61作用組(q=8.359，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用組Bcl-2低于10 μmol/LGANT61作用組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(q=5.173，P<0.01)；GANT61上調(diào)LOVO細胞中Fas蛋白表達水平，三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.815,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用組Fas高于0 μmol/LGANT61作用組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(q=47.360，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用組Fas高于10 μmol/LGANT61作用組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(q=9.635，P<0.01)；GANT61上調(diào)LOVO細胞中Caspase-3蛋白水平，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=257.427,P<0.01)，10 μmol/LGANT61作用組Caspase-3表達水平高于0 μmol/LGANT61作用組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(q=15.491，P<0.01)，20 mol/LGANT61作用組Caspase-3表達水平高于10 μmol/LGANT61作用組(q=16.591，P<0.01)，見表1。

表1 流式細胞術(shù)檢測不同濃度GANT61作用LOVO細胞24 h細胞中Fas、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達水平

3 討論

Hh信號通路主要由多種成分構(gòu)成，主要包括Hh配體、Ptch、Smo、Gli以及下游靶基因等構(gòu)成，其通路的異?；罨谀[瘤形成和侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特性的維持中發(fā)揮重要作用，針對其通路的靶向抑制也成為抗腫瘤治療的熱點。Gli包括3種活化形式，活化的Gli1和Gli2能夠調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響細胞生長增殖和細胞凋亡，從而導(dǎo)致異常組織的發(fā)生，甚至腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可見Gli1和Gli2在細胞的自我更新和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[6-8]。

細胞凋亡是調(diào)節(jié)人體正常發(fā)育不可缺少的一種機制，一旦該機制出現(xiàn)紊亂時可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此探尋誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的藥物為抗腫瘤研究提供新的思路。GANT61作為Gli基因的抑制劑，能夠抑制Gli等轉(zhuǎn)錄因子的活性，對Gli下游的多種基因進行調(diào)控，阻斷SHH通路信號和促進腫瘤細胞凋亡，從而起到抗腫瘤的作用[9-10]。Bcl-2家族在細胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，研究表明[11-12]Bcl-2蛋白水平的高低與凋亡直接相關(guān)，Bcl-2高表達可以通過抑制凋亡調(diào)控從而影響細胞凋亡。Fas作為一種分子受體，是一種跨膜糖蛋白，F(xiàn)as可特異性地與FasL結(jié)合，在Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細胞凋亡信號過程中，形成三聚體，把胞外信號轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，介導(dǎo)細胞凋亡，其表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及自身免疫性疾病密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，GANT61可以下調(diào)LOVO細胞Gli1(F=509.791，P=0.000)、Gli2(F=475.072，P=0.000)和Bcl-2(F=534.335，P=0.000)蛋白表達；增加Fas(F=9433.507，P=0.00)蛋白表達，且具有劑量依賴性。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，不同濃度GANT61作用于LOVO細胞后凋亡率3組間比較差異顯著(F=960.768，P=0.000)。許尚虞等[14]研究表明不同濃度的GANT61能通過抑制Gli1的表達，下調(diào)靶基因Bcl-2的表達，從而明顯抑制髓母細胞瘤的增殖活性，達到促進髓母細胞瘤細胞凋亡的作用[14]。與郭麗梅[15]、Helen[16]以及王雷[17]研究結(jié)果一致。

Caspase-3是誘導(dǎo)細胞凋亡的最重要因子，是細胞凋亡的啟動者和執(zhí)行者，被激活后，可以使細胞內(nèi)與細胞周期、DNA核酸復(fù)制與轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的酶失活，從而導(dǎo)致細胞凋亡[18-20]。Srivastava等[21]研究發(fā)現(xiàn)抑制劑GANT61通過下調(diào)Gli1、Gli2蛋白在肉瘤細胞中的表達，上調(diào)Caspase3表達，從而增強抗腫瘤細胞作用和促進腫瘤細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，對于Bcl-2,GANT61可以劑量依賴性下調(diào)LOVO細胞中Bcl-2蛋白表達水平，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.624,P<0.01)，對于Fas,GANT61上調(diào)LOVO細胞中Fas蛋白表達水平，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=66.815,P<0.01)，對于Caspase-3，GANT61上調(diào)LOVO細胞中Caspase-3蛋白水平，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=257.427,P<0.01)。Hedgehog-Gli信號通路是與Ruizi[22]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞Gli1高表達，并能上調(diào)腫瘤干細胞樣因子的表達，從而增強結(jié)腸癌細胞的侵襲力。Varnat等[23]研究轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌模型發(fā)現(xiàn)，當(dāng)增強Hh信號通路表達時，結(jié)腸直腸癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移性生長顯著增快。當(dāng)抑制信號通路表達時，癌癥的侵襲力和轉(zhuǎn)移能力下降。Douard等[24]通過RT-PCR分析結(jié)腸直腸癌樣本Shh及下游Gli的表達發(fā)現(xiàn)，Shh及Gli異常高表達。且發(fā)現(xiàn)阻斷內(nèi)源性Shh表達后，細胞增殖受抑制。Hh信號通路在結(jié)腸直腸癌侵襲、增殖及轉(zhuǎn)移中的作用，為臨床提供新的治療方向[25-26]。

綜上所述，GANT61通過下調(diào)Gli蛋白表達從而抑制結(jié)直腸癌細胞的生長增殖和侵襲能力，提示Gli在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，有可能成為結(jié)直腸癌靶向治療提供新的治療途徑。