陶柏楠，金錚鈺，張 鈺，萬 星,3*

1.湖北民族大學風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大學醫(yī)學部(湖北 恩施 445000) 3.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院(四川 成都 610064)

兒茶素類單體以C6-C3-C6為基本骨架，C3環(huán)上C2和C3為手性碳原子，由于取代基不同，常見的兒茶素單體有8種：(+)-兒茶素(Catechin,C)、(-)-表兒茶素(epicatechin,EC)、(+)-沒食子兒茶素(gallocatechin,GC)、(-)-表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)、(+)-兒茶素沒食子酸(catechingallate,CG)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(epicatechingallate，ECG)、(+)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechingallate,GCG)與表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)[1]。主要在茶葉以及一些中藥材中提取獲得[2]，根據(jù)其分子式，市面已有合成的單體成品，這一類物質通常具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、抗突變、預防心血管疾病[6]等多種作用。課題組前期在開發(fā)抗肝纖維化藥物時，從鬼箭羽醇提物中發(fā)現(xiàn)兒茶素的效能極高[7]，而現(xiàn)有文獻報道EC和EGCG同樣具有抗肝纖維化作用[8-9]，但是由于極性大，吸收和生物利用度不高，目前仍然處于改構和研發(fā)階段[10]，由于C取代基上的-OH遠少于EGCG，因此，C的藥代參數(shù)是否更利于成藥，本文在前期工作基礎上將對C做出藥代學參數(shù)分析，為藥物研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1藥品與動物兒茶素(上海源葉生物，LOT：P20O7F23087)；甲醇、乙腈(上海麥克林生化科技有限公司，色譜純)；5 mL肝素抗凝管(河北鑫樂醫(yī)療器械科技股份有限公司)；PE材質動脈插管(北京GLOBALEBO)；PVC材質輸液管(河南曙光生物科技有限公司)；新西蘭兔(湖北逸摯誠生物科技有限公司，許可證號：SCXK(鄂)2021-0020)。

1.2主要儀器高效液相色譜儀(日本島津，LC-2030C 3D)；氮吹儀(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司，UGC-12M)。

1.3方法

1.3.1 藥物的配置 精確稱取500 mg的兒茶素，加生理鹽水定容到62.5 mL，配成8 mg/mL的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。新西蘭兔耳緣靜脈給藥劑量為10 mg/kg。

1.3.2 新西蘭兔頸總動脈插管 新西蘭兔20%烏拉坦5 mL/kg麻醉固定，頸部手術，氣管插管，分離頸總動脈鞘，游離頸總動脈至少2 cm長，遠心端絲線結扎，近心端動脈夾夾持，在離近心端較近的地方剪一V型切口，按實驗分組選取PE管進行深度和淺度插管，用裝有肝素的注射器進行封堵，將注射器固定于鐵架臺上，再移開動脈夾。

1.3.3 新西蘭兔頸外靜脈插管 采用1.3.2同樣方法，分離頸外靜脈2～3 cm，按實驗要求選取PE或PVC插管進行淺插或者深插，淺插至深插分別為插管從切口處向前推進2、4 cm和至上腔靜脈中(6 cm)，每只兔子每種深度每隔1 min采血1次，連采3次。

1.3.4 給藥及樣品采集 取6只新西蘭家兔，實驗前12 h禁食不禁水，按照上述方法，用PVC材質插管進行深插，先用抗凝管采2 mL正常血液，然后以10 mg/kg的劑量耳緣靜脈注射兒茶素，于給藥后2 min、5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h從插管處采血2 mL，靜置15 min，3 500 r/min離心10 min，取上清血漿-20℃保存。

1.3.5 兒茶素標準品溶液配置 分析天平精確稱取兒茶素，加空白血漿溶解配成200 μg/mL的母液。按梯度稀釋法用空白血漿依次稀釋成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156、0.078 μg/mL，再進行樣品處理，上機。

1.3.6 樣品預處理 標曲的樣品取350 μL，加1 575 μL乙腈后，10 000r/min,離心10 min。取1 600 μL上清，氮吹儀吹干，500 μL甲醇復溶上機。采血點的樣品取600 μL，加2 700 μL乙腈后，10 000 r/min,離心10 min。取2 800 μL上清，氮吹儀吹干，500 μL甲醇復溶上機。

1.4色譜條件色譜柱：InertSustainC18柱(250 mm×4.6 mm，5μ m)，流動相：0.3%冰醋酸(A)—乙腈(B)，等度洗脫：92%冰醋酸+8%乙腈，流速：0.8 mL/min，柱溫：25℃，進樣量20 μL，檢測波長278 nm[11]。

1.5方法專屬性考察考察兒茶素甲醇溶劑，400 μg/mL兒茶素血漿、20 μg/mL兒茶素血漿，第一只新西蘭兔2 min采血點樣品的色譜圖。

1.6方法學考察精密度考察：配置5、1.25、0.3125 μg/mL的標準品各1份，分別同一天上機6次，計算各濃度兒茶素日內RSD。重復性考察：配置5、1.25、0.312 5 μg/mL的標準品各一份，每份樣品連續(xù)測定3 d，計算日間RSD。穩(wěn)定性考察：配置5 μg/mL的標準品3份，1份凍融3次，1份室溫放置0、6、12 h，1份4℃儲存0、7、14 d，分別上機3次，計算RSD。

1.7藥代動力學參數(shù)測定把時間和濃度輸入Das 2.0軟件，選擇智能分析得出其房室模型，再利用成批數(shù)據(jù)分析其藥代動力學參數(shù)，報導統(tǒng)計矩結果。

2 結果

2.1不同材質插管對溶血影響PE材質插管頸動脈采血時會導致嚴重的溶血，頸靜脈采血時，會隨著插管深度，流速加快，溶血程度增加，而PVC材質插管時，頸外靜脈采血無論插管深淺，都不致溶血，見表1。

表1 不同材料和插管深度對溶血的影響(n=6)

2.2PVC材質插管深度對采血時程的影響藥代實驗采血時間點是否準確對藥時曲線形成影響重大，即對藥代參數(shù)影響很大，因此，用PVC插管進行頸外靜脈插管時，同時記錄了采血所需時間。結果顯示：采血2 mL，淺插2 cm需(55±5)s完成，中插4 cm需要(31.7±2.9)s完成，深插6 cm(即至上腔靜脈)需(12±2)s完成，見圖1。

圖1 插管深度對采血時間的影響(n=6)

2.3HPLC方法專屬性考察在本色譜條件下，兒茶素被分離開，定位清晰不受血漿中雜質的干擾，專屬性強，其保留時間約為40.729 min，見圖2。

(A:標準品溶于甲醇；B:血漿中400 μg/mL兒茶素；C:血漿中20 μg/mL兒茶素；D:2 min的采樣)

2.4HPLC法精密度與重復性考察選取5、1.25、0.312 5 μg/mL的標準品，按照1.3.6方法處理上機，測得峰面積并計算濃度，以相對標準差RSD表示精密度，結果顯示：低中高濃度的兒茶素日內RSD<3%，見表2。

表2 HPLC法考察兒茶素的精密度與重復性

2.5HPLC法考察兒茶素穩(wěn)定性配置5 μg/mL的標準品三份，一份凍融三次，一份室溫放置0、6、12 h，一份4℃儲存0、7、14 d，凍融、室溫放置和4℃儲存的RSD(%)分別為：1.91、3.53、1.89，見表3。

表3 HPLC法考察兒茶素的穩(wěn)定性

2.6標準曲線及兒茶素單劑量靜脈注射的藥時曲線利用外標法測標準曲線，按照1.3.5方法配置標準溶液，1.3.6方法上機測峰面積，得出峰面積與濃度之間的方程式S=7400.3C-213.28，R2=0.999表明線性關系良好。兒茶素耳緣靜脈注射后的藥時曲線如圖3B，圖C和圖D為其中3只家兔兒茶素的C(濃度)-t(時間)曲線和對應的LnC-t曲線。

A:標準曲線；B:6只兔濃度-時間曲線；C:每只兔濃度-時間曲線,D:LnC-t曲線。

2.7兒茶素在兔體內的藥代動力學參數(shù)將血藥濃度帶入Das 2.0軟件。經過計算機模擬，首先進行房室模擬：最佳房室為三室w=1，次佳房室為二室w=1，以三室權重1求得統(tǒng)計矩參數(shù)如表4。

表4 兒茶素在兔體內的藥代動力學參數(shù)

3 討論

藥時曲線準確的前提之一就是采血點的準確和不發(fā)生溶血。PE材質的插管不論做靜脈采血還是動脈采血，均導致不同程度地溶血，PVC材質插管不會導致溶血。

采血點時程越短，代表該采血點藥物濃度更準確，經過實驗驗證，靜脈插管時，插管越深離心臟越近，出血速度越快，能在12 s左右完成家兔2 mL采血。同時預實驗提示長時程采血宜用插管采血，耳緣靜脈、心臟采血不適合長時程大量采血。

本課題組在研發(fā)抗肝纖維化藥物時，從鬼箭羽醇提物中提取兒茶素單體，發(fā)現(xiàn)兒茶素抗肝纖維化的效能極高[7]，但鑒于同類EGCG同樣具有抗肝纖維化功效卻由于極性高生物利用度低面臨改造等問題，課題組對兒茶素的藥代學展開研究，發(fā)現(xiàn)AUC值較大，說明兒茶素有一定量吸收，結合藥時曲線上濃度迅速降低的表現(xiàn)推測藥物可能迅速被代謝成其他物質，需進一步研究分析，但僅存的兒茶素半衰期約7.5 h，該數(shù)據(jù)對藥物口服、靜脈注射均有較大優(yōu)勢，同時表觀分布容積V較大，遠超出血漿量，提示兒茶素主要分布在血漿以外的組織，對治療實體臟器的疾病優(yōu)勢會更高，該角度也解釋為什么兒茶素抗肝纖維化效果好。

總之，從藥代學參數(shù)出發(fā)，開發(fā)兒茶素的價值較大，至于兒茶素發(fā)揮藥效是物質原型還是代謝物有待進一步研究。