呂麗娟，王祥培，徐 鋒，黃芯琦，鐘 可，吳紅梅*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(貴州 貴陽 550025) 2.貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院(貴州 貴陽 550025) 3.眉山市中醫(yī)醫(yī)院(四川 眉山 620010)

石韋為水龍骨科植物石韋(Pyrrosialingua(Thunb.)Farwell)、有柄石韋(Pyrrosiapetiolosa(Christ)Ching)和廬山石韋(Pyrrosiasheareri(Bak.)Ching)的干燥葉，為基源相近的多種源性中藥，都具有利尿通淋，清肺止咳，涼血止血的相同功效[1]，臨床常應(yīng)用于泌尿系統(tǒng)疾病[2]。泌尿系統(tǒng)類疾病與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系[3]，藥效學(xué)研究表明石韋和有柄石韋均具有抗炎作用[4-5]。盡管藥典和文獻(xiàn)上收錄和報(bào)道了不同基源的同屬石韋，但品種之間存在個(gè)體差異[6]，多基源品種石韋抗炎作用機(jī)制的相似性和差異性目前缺乏闡述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接能通過構(gòu)建和整合“成分-靶標(biāo)-疾病”多層次網(wǎng)絡(luò)，分析特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，高效研究其活性成分,并驗(yàn)證核心靶點(diǎn)與炎癥之間的親和力，從系統(tǒng)、整體角度探索藥物與機(jī)體的相互作用，有助于闡明多基源品種石韋發(fā)揮抗炎作用時(shí)多組分和多靶標(biāo)之間潛在的復(fù)雜關(guān)系[7]。因此本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接角度，對(duì)多基源品種石韋發(fā)揮抗炎作用機(jī)制的異同進(jìn)行研究。

1 方法

1.1藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過查閱相關(guān)數(shù)據(jù)庫(CNKI、PubMed)查找石韋(SW)、有柄石韋(YB)和廬山石韋(LS)的所有成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以ADME參數(shù)(OB≥30%和DL≥0.18)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)藥效活性為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出候選化合物。

1.2疾病靶點(diǎn)的建立利用人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫(OMIM，http://www.omim.org/)與GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“Inflammation”為關(guān)鍵詞，檢索“炎癥”相關(guān)的靶點(diǎn)，整合所有靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。最后，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將上述篩選得到的所有靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化成UniProt ID格式。

1.3“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將石韋、有柄石韋、廬山石韋和疾病數(shù)據(jù)庫得到的靶點(diǎn)繪制韋恩圖，存在于韋恩圖交集中的靶點(diǎn)視為多基源品種石韋抗炎的潛在核心靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.6.1軟件將藥物靶點(diǎn)、炎癥靶點(diǎn)和交互蛋白對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)連接成“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。以網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)“節(jié)點(diǎn)連接度”(Degree)、“節(jié)點(diǎn)介度”(Betweenness centrality)、“節(jié)點(diǎn)緊密度”(Closeness centrality)的中位數(shù)為卡值，選擇以上3個(gè)拓?fù)鋮?shù)值滿足分別大于所有點(diǎn)中位數(shù)值的靶點(diǎn)，作為多基源品種石韋抗炎的核心靶點(diǎn)。

1.4GOKEGG富集分析將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI network，protein protein interaction network)。通過Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行KEGG通路分析和GO(Gene Ontology)生物學(xué)過程分析。

1.5分子對(duì)接在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中下載靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件。在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載化合物3D結(jié)構(gòu)的sdf格式。使用DockThor[8]進(jìn)行分子對(duì)接，得到活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)合親和力(Affinity，kcal/mol)，最后通過LigPlot實(shí)現(xiàn)可視化。

2 結(jié)果

2.1藥物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以ADME參數(shù)(OB≥30%和DL≥0.18)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)藥效活性[9-23]，石韋篩選出26個(gè)候選化合物，有柄石韋篩選出22個(gè)候選化合物，廬山石韋篩選出13個(gè)候選化合物。

2.2交集靶點(diǎn)的篩選根據(jù)OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫，查找得到9 928個(gè)炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)，并與石韋、有柄石韋和廬山石韋有效成分的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配并繪制韋恩圖(見圖1)；圖中炎癥與石韋特有的交集靶點(diǎn)39個(gè)，炎癥與有柄石韋特有的交集靶點(diǎn)8個(gè)；炎癥與多基源品種石韋相同的交集靶點(diǎn)33個(gè)。結(jié)果表明多基源品種石韋能通過相同的作用靶點(diǎn)和各自特有的作用靶點(diǎn)調(diào)控炎癥。

圖1 疾病靶點(diǎn)基因與多基源品種石韋靶點(diǎn)匹配的韋恩圖

2.3交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建利用Cytoscape 3.6.1軟件將以上96個(gè)炎癥與石韋的交集靶點(diǎn)，69個(gè)炎癥與有柄石韋的交集靶點(diǎn)，41個(gè)炎癥與廬山石韋的交集靶點(diǎn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建出多基源品種石韋防治炎癥作用的交互網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明石韋發(fā)揮抗炎藥效的潛在活性成分12個(gè)，其特有的潛在活性成分有山奈酚-3-阿拉伯呋喃糖苷、高麗槐素、槲皮素，4-o-葡萄糖苷、異熱馬酮、原兒茶酸、槲皮素；有柄石韋發(fā)揮抗炎藥效的潛在活性成分21個(gè)，其特有的潛在活性成分有植物醇、酞酸二乙酯、十六烷等8個(gè)；廬山石韋發(fā)揮抗炎藥效的潛在活性成分13個(gè)。多基源品種石韋相同的活性成分為蔗糖、綠蓮皂苷元、β谷甾醇和香草醛酸，見圖2，表明多基源品種石韋抗炎潛在活性成分的相似性小，差異性大；其中廬山石韋和有柄石韋抗炎的活性成分較為相似。

圖2 多基源品種石韋抗炎作用的“成分-靶點(diǎn)-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

2.4多基源品種石韋抗炎的直接作用靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析結(jié)合Cytoscape 3.6.1交互網(wǎng)絡(luò)分析，篩選多基源品種石韋活性成分相關(guān)聯(lián)的蛋白靶點(diǎn)，以網(wǎng)絡(luò)中所有蛋白靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)均值作為計(jì)算結(jié)果，石韋得到3個(gè)拓?fù)鋮?shù)分別為：2、0.000 5和0.48，有柄石韋得到3個(gè)拓?fù)鋮?shù)分別為：2、0.001 7和0.454 5，廬山石韋得到3個(gè)拓?fù)鋮?shù)分別為：2、0.006 2和0.457 6。選擇3個(gè)拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)均值的靶點(diǎn)作為多基源品種石韋治療炎癥的核心靶點(diǎn)，最終篩選出石韋56個(gè)核心靶點(diǎn)、有柄石韋35個(gè)核心靶點(diǎn)、廬山石韋21個(gè)核心靶點(diǎn)。通過繪制韋恩圖分析，多基源品種石韋相同的核心靶點(diǎn)14個(gè)。石韋特有的核心靶點(diǎn)24個(gè)，有柄石韋特有的核心靶點(diǎn)4個(gè)；表明多基源品種石韋抗炎核心靶點(diǎn)的相似性小，差異性大，見圖3。

圖3 多基源品種石韋作用靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)分析的韋恩圖

采用String數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI network，并在Cytoscape 3.6.1中可視化，構(gòu)建蛋白互作關(guān)系圖，見圖4～6。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的邊代表蛋白與蛋白的相互作用，標(biāo)簽顏色隨Degree增大而加深。分析結(jié)果表明，CASP3、PPARG、RELA等在石韋抗炎的過程中起重要作用；CASP3、PPARG、FOS等在有柄石韋抗炎的過程中起重要作用；ESR1、NOS3、SREBF1等在廬山石韋抗炎的過程中起重要作用。

圖4 石韋抗炎作用的核心靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系圖

2.5GO生物學(xué)功能富集分析分別將石韋56個(gè)核心靶點(diǎn)、有柄石韋35個(gè)核心靶點(diǎn)、廬山石韋21個(gè)核心靶點(diǎn)映射到DAVID數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析，結(jié)果共富集得到石韋123條生物過程(Biological Process，BP)，26條細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)，47條分子功能(Molecular Function，MF)；有柄石韋共富集得到71條BP，14條CC，29條MF；共富集得到廬山石韋33條生物過程BP，10條CC，20條MF。其中多基源品種石韋抗炎參與相同的生物過程20條，石韋抗炎特有的生物過程77條，有柄石韋抗炎特有的生物過程18條，廬山石韋抗炎特有的生物過程4條，說明多基源品種石韋的生物過程有相似性小，差異性大，見圖7。

圖5 有柄石韋抗炎作用的核心靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系圖

圖6 廬山石韋抗炎作用的核心靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系圖

圖7 多基源品種石韋GO生物學(xué)功能富集分析的BP韋恩圖

2.6KEGG通路分析分別將石韋56個(gè)核心靶點(diǎn)、有柄石韋35個(gè)核心靶點(diǎn)、廬山石韋21個(gè)核心靶點(diǎn)通過DAVID進(jìn)行KEGG富集分析，共富集得到石韋46條信號(hào)通路，有柄石韋19條信號(hào)通路，廬山石韋7條信號(hào)通路。其中多基源品種石韋抗炎調(diào)控相同的信號(hào)通路有膽堿能突觸信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路；石韋抗炎特有的信號(hào)通路有29個(gè)；有柄石韋抗炎特有的信號(hào)通路有3個(gè)；廬山石韋抗炎特有的信號(hào)通路有3個(gè)；表明多基源品種石韋發(fā)揮抗炎作用的信號(hào)通路有相似性小，差異性大，見圖8。

圖8 多基源品種石韋KEGG通路富集分析的韋恩圖

2.7關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接PPI中具有較高Degree值的節(jié)點(diǎn)，被認(rèn)為是關(guān)鍵靶點(diǎn)，本研究石韋和有柄石韋排名前2的關(guān)鍵靶點(diǎn)CASP3、PPARG，以及廬山石韋排名前2的關(guān)鍵靶點(diǎn)ESR1、NOS3，分別與品種多基源石韋抗炎作用交互網(wǎng)絡(luò)中Degree值排名前10的活性成分分子對(duì)接。Affinity<-5.0 kcal/moL，表示有較好的結(jié)合活性，且Affinity絕對(duì)值越大，配體與受體之間的結(jié)合能力越穩(wěn)定[24]。其中β-谷甾醇、高麗槐素、甲基黃連堿等14個(gè)成分的親和力優(yōu)于臨床藥物吲哚美辛。結(jié)果顯示關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合相對(duì)較穩(wěn)定，與網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)的篩選結(jié)果基本一致，見表1。

表1 活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接表

3 討論

多基源品種是中國(guó)傳統(tǒng)藥物的常見現(xiàn)象，也是中藥的重要組成部分。目前多基源藥材僅研究了不同基源之間的成分、藥效存在差異[25-26]，但是其作用機(jī)制的異同尚不明確?；诖?，本文以多基源品種的石韋為例，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，探討多基源品種作用機(jī)制的相似性和差異性。

3.1多基源品種石韋抗炎的作用機(jī)制的相似性網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，多基源品種石韋抗炎的活性成分都具有蔗糖、綠蓮皂苷元、β谷甾醇和香草醛酸；分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果顯示石韋、有柄石韋、廬山石韋多基源品種中的綠蓮皂苷元、β谷甾醇與抗炎的靶蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)；現(xiàn)代研究表明[27]β谷甾醇具有抗炎的作用，綠蓮皂苷元可調(diào)控炎癥反應(yīng)[28]，與驗(yàn)證結(jié)果相符。多基源品種石韋相同的核心靶點(diǎn)有PTGS1、PRSS1、SREBF1、NOS3、AR等14個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)激活雄激素受體(AR)是調(diào)節(jié)多種炎癥標(biāo)志物的重要因素[29]。通過下調(diào)甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBF1)能發(fā)揮抗炎作用[30]。多基源品種石韋抗炎參與相同的生物過程有腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號(hào)通路等20條。多基源品種石韋抗炎調(diào)節(jié)相同的信號(hào)通路有膽堿能突觸信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路。相關(guān)藥理研究表明，通過“膽堿能抗炎通路”能減輕膿毒癥外周炎癥反應(yīng)[31]。

3.2多基源品種石韋抗炎作用機(jī)制的差異性石韋發(fā)揮抗炎特有的潛在活性成分為山奈酚-3-阿拉伯呋喃糖苷、高麗槐素、槲皮素，4-o-葡萄糖苷、異熱馬酮、原兒茶酸、槲皮素。槲皮素可通過抑制炎性細(xì)胞因子而發(fā)揮抗炎作用，改善早期糖尿病腎病[32]。分子對(duì)接結(jié)果表明，14個(gè)成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較強(qiáng)親和力。說明品種不同，其所含的抗炎活性成分有差異，導(dǎo)致抗炎的靶點(diǎn)、信號(hào)通路有差異。石韋抗炎特有的核心靶點(diǎn)為PRKCA、ALOX5、RELA等24個(gè)。研究表明5-脂氧酶(ALOX5)催化花生四烯酸代謝產(chǎn)生的白三烯是參與炎癥的重要介質(zhì)，動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)，且ALOX5基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與人類動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病相關(guān)[33]。提示石韋品種具潛在特有治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。糖尿病是一種慢性低水平的全身炎癥性疾病，降低轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)能發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善糖尿病[34]。通過靶向調(diào)控蛋白激酶Cα(PRKCA)，能有效治療2型糖尿病[35]。石韋抗炎特有的信號(hào)通路為TNF信號(hào)通路、乙型肝炎、細(xì)胞凋亡等29個(gè)。調(diào)節(jié)鞘脂信號(hào)通路能延緩糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變[36]。因此，可推斷石韋專注于治療泌尿系統(tǒng)感染。

有柄石韋抗炎特有的潛在活性成分為植物醇、酞酸二乙酯、十六烷、二氫咖啡酸、癸醛、圣草酚、正十六烷酸、鄰苯二甲酸二異丁酯。圣草酚緩解小鼠結(jié)腸炎,可能與激活Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗炎作用有關(guān)[37]，提示有柄石韋具潛在特有治療結(jié)腸炎的作用。分子對(duì)接結(jié)果表明不同基源，其所含的抗炎活性成分、抗炎的靶點(diǎn)、信號(hào)通路有差異。有柄石韋抗炎特有的活性靶點(diǎn)有LPL、NFE2L2、NQO1、GSK3B。王湧濤等[38]研究表明調(diào)控LPL能改善糖尿病的糖脂代謝,預(yù)防其慢性并發(fā)癥的發(fā)生；并且調(diào)控NQO1能治療1型糖尿病[39]。因此，可推斷有柄石韋專注于治療泌尿系統(tǒng)感染。核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(NFE2L2)主要通過NFE2L2-Keap1-ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善主動(dòng)脈夾層[40]。提示廬山石韋具潛在特有治療主動(dòng)脈夾層的作用。有柄石韋抗炎特有的信號(hào)通路為PPAR信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路。催乳素信號(hào)通路能通過調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答從而治療卒中后抑郁[41]。提示有柄石韋具潛在特有治療卒中后抑郁的作用。

廬山石韋發(fā)揮抗炎特有的信號(hào)通路為精氨酸生物合成、cGMP-PKG信號(hào)通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。cGMP-PKG信號(hào)通路在機(jī)體免疫或炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性作用，進(jìn)而發(fā)揮延緩結(jié)核的發(fā)病狀態(tài)或結(jié)核病進(jìn)展作用[42]。提示廬山石韋具潛在特有治療肺結(jié)核疾病的作用。

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)石韋、有柄石韋、廬山石韋多基源品種抗炎的活性成分和作用機(jī)制相似性小、差異性較大。多基源品種石韋能通過各自特有的活性成分、核心靶點(diǎn)、信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用，表明不同基源石韋在治療炎癥相關(guān)的疾病有各自不同的側(cè)重點(diǎn)。提示多基源品種石韋在臨床上防治炎癥時(shí)有其各自的特色，要區(qū)別對(duì)待，本研究為多基源品種石韋的臨床使用和開發(fā)應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為多基源品種作用機(jī)制的闡述提供了新思路。