徐春暉，王 瑤，杜俊民

（山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619）

隨著全球人口老齡化，與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病越來越普遍，阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease, AD）是老年人群中最常見的癡呆癥[1]。最近的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界約有5 000萬人患有阿爾茨海默癥或其他類型的癡呆癥，影響著全球超過3 500萬人，年輕人也可能患AD。患病后會導(dǎo)致海馬區(qū)以及大腦皮層大量淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和特定腦區(qū)選擇性神經(jīng)元和突觸丟失[2]。研究證明，神經(jīng)酸能夠恢復(fù)神經(jīng)末稍活性，促進神經(jīng)細胞生長和發(fā)育，能夠明顯治療和預(yù)防阿爾茨海默病[3-4]。文冠果（Xanthoceras sorbifolia Bunge），別名文冠木、文官果、土木瓜、木瓜、溫旦革子，為無患子科（Sapindaceae）文冠果屬植物文冠果的木材或枝葉，是自然界富含神經(jīng)酸的植物資源[5]。文冠果油占種子仁的55%～65%，其中含有大約95%的甘油三酯，具有預(yù)防和治療高血壓、血管硬化等心血管病的作用。張東等[6]檢測到文冠果油芥酸含量為 8.41%，動物試驗表明大量攝入含芥酸的油脂，心臟會是主要的中毒器官，可致心肌纖維化引起心肌病變，引起動物增重遲緩，發(fā)育不良?？赡軙νㄟ^文冠果油攝取神經(jīng)酸的心臟病消費者不利，同時限制了文冠果油的應(yīng)用。盡管還未有確切報道表明其對人體的有害作用，但為保障人群健康，更應(yīng)該加以重視文冠果油的質(zhì)量，并采取行動[7]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織已規(guī)定油脂中的芥酸含量應(yīng)低于5%。

目前人們主要通過基因育種培育低芥酸植物，達到降低芥酸的目的，這種方法耗費時間長，操作要求高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，市場上還沒有出現(xiàn)低芥酸文冠果植物。相關(guān)文獻研究表明，海甘藍和高芥酸甘藍型油菜油中的長碳鏈的芥酸主要位于甘油三酯的 Sn-1、Sn-3位，而 Sn-2位芥酸含量較低[8]。本實驗選用了Sn-1,3位置專一性脂肪酶 TLIM[9]與文冠果油進行反應(yīng)，脂肪酶TLIM 可把甘油骨架的 Sn-1,3位脂肪酸水解為游離脂肪酸。酶催化法具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)較少、產(chǎn)品質(zhì)量好和收率高等優(yōu)點，文冠果油的酶解脫除芥酸工藝的研究還未見報道。

本文以文冠果油為原料，以芥酸含量為評價指標，采用脂肪酶TLIM對酶解工藝條件進行優(yōu)化，為降低文冠果油中的芥酸含量提高一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

文冠果油實驗室自行榨取。

甲醇鈉溶液（0.1 mol/L）、乙酸溶液（10%體積分數(shù)）、硫酸甲醇溶液（0.1 mol/L）、正己烷、石油醚、無水乙醇、氫氧化鉀、酚酞：市售分析純；固定化脂肪酶Lipozyme TLIM：北京高瑞森科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀：美國Agilent公司；800-1離心機：惠智儀誠（北京）科技發(fā)展有限公司；85-2B數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.3 實驗方法

精確稱量文冠果油，加入不同量的固定化脂肪酶TLIM和水，混勻，移入廣口瓶中。不同溫度條件下，反應(yīng)一段時間，取出油樣，使用離心機離心，取上層清液將甲酯化，利用氣相色譜檢測文冠果甘油酯的芥酸含量。

1.3.1 酸價的測定

水解前后的樣品其酸價用冷溶劑法測定。精確稱取約文冠果油5 g，溶解在50 mL石油醚和95%乙醇（體積比為1∶1）的混合溶液中，滴加0.15 mL的酚酞指示劑（10 g/L，10 g酚酞溶解在1 L95%的乙醇溶液中），用0.1 mol/L（實際濃度為0.098 mol/L）的氫氧化鉀乙醇標準溶液準確中和滴定。三份試樣平行滴定，一份空白對照，取滴定所用氫氧化鉀標準液的平均值，結(jié)果按以下公式計算。

式中：m—稱取油樣的質(zhì)量，mg；V—滴定所用氫氧化鉀溶液的體積，mL；C—氫氧化鉀溶液的實際物質(zhì)的量濃度，mol/L；56.1—氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量。

1.3.2 不同甲酯化方法對比

取5 μL文冠果油或最佳條件酶解后產(chǎn)物放置于2支試管中，分別加入5滴硫酸甲醇溶液，制備成高酸價油脂甲酯化樣品（酸價大于3.0）；加入甲醇鈉溶液（0.1 mol/L）制備成低酸價甲酯化樣品（酸價小于3.0）。搖勻，室溫反應(yīng)30 min，加入 5滴乙酸溶液（10%體積分數(shù)），搖勻終止反應(yīng)，加入5～10滴正己烷，搖勻，靜置15 min。

1.3.3 TLIM酶添加量對芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分數(shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%TLIM 酶，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，在50 ℃下，反應(yīng)0.5 h。

1.3.4 溫度對芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分數(shù)7% TLIM酶，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，分別在40、45、50、55、60 ℃下，反應(yīng)0.5 h。

1.3.5 反應(yīng)時間芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，根據(jù)水油摩爾比為40∶1加入水，加入質(zhì)量分數(shù)7%TLIM酶，在45 ℃下分別反應(yīng)2、3、4、5、6 h。

1.3.6 水油摩爾比對芥酸含量的影響

取10 g文冠果油，加入質(zhì)量分數(shù)7%TLIM酶，水油摩爾比分別控制為10∶1、20∶1、30 ∶1、40∶1、50∶1，在45 ℃下，反應(yīng)5 h。

1.3.7 正交實驗

根據(jù) TLIM脂肪酶酶解條件的單因素測定結(jié)果，對酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）、水油摩爾比（D）4個因素分別展開3個水平，進行L9(34)正交實驗，具體因素及水平見表 1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.8 氣相色譜測定芥酸含量的色譜條件

色譜柱：30.0 m×320 μm 毛細管，膜厚0.25 μm，流速 1 mL/min。柱箱：初始溫度為180 ℃，平衡 1 min，以 20 ℃/min的速率保持4 min、運行 4 min，以 10 ℃/min的速率保持8 min、運行 15 min；檢測器：加熱器 250 ℃。采用面積歸一化法定量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗組設(shè)三個平行實驗，數(shù)據(jù)采用Origin2018進行處理，正交設(shè)計助手專業(yè)版V3.1破解綠色版對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解前后酸價的比較

根據(jù)圖 1文冠果油的酸價從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g。

圖1 文冠果油水解反應(yīng)酸價的變化Fig.1 Changes of acid value in the hydrolysis reaction of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil

2.2 不同甲酯化方法對比

混合物中的甘油三酯、甘油二酯、單甘酯都是沸點較高的油脂類物質(zhì)，不容易氣化，要分析脂肪酸組成和含量，需要預(yù)先進行衍生化，衍生化后的產(chǎn)物沸點變低，容易氣化[10]。本實驗采用酸法和堿法兩種不同的甲酯化方法，對文冠果油進行衍生化。

根據(jù)張浩對兩種甲酯化方法進行對比的結(jié)果，堿法更適合甘油三酯的衍生化（酸價大于3.0），而酸法為游離脂肪酸的衍生化的最佳方法[11]。從圖2可以看出脂肪酶水解文冠果油后甘油三酯中的芥酸含量降低，游離脂肪酸中的芥酸含量升高，文冠果油的酸價從 1.12 mgKOH/g升高到126.06 mgKOH/g，說明以甘油三酯為主的文冠果油轉(zhuǎn)變?yōu)橐杂坞x酸形式為主，脂肪酸存在形式發(fā)生轉(zhuǎn)變，同時檢測到游離酸中芥酸含量由水解前12.31%增加到水解后的17.51%，可以初步斷定芥酸從甘油三酯上水解下來，變?yōu)橛坞x芥酸。由于產(chǎn)品的最終形式為甘油三酯成分為主，所以本實驗均采用堿法甲酯化，進行衍生化。

圖2 兩種甲酯化方法比較Fig.2 Comparison of two methyl esterification methods

2.3 不同TLIM酶添加量對芥酸含量的影響

在水解的過程中起著催化作用的 TLIM酶具有位置專一性，能特異性水解甘油三酯Sn-1,3位上的脂肪酸，本實驗研究了不同TLIM酶添加量對酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 TLIM酶添加量對芥酸含量的影響Fig.3 Effect of TLIM enzyme addition on erucic acid content

圖3顯示，芥酸含量隨著加酶量的增加先緩慢降低，在TLIM酶質(zhì)量分數(shù)為7%時達到最低后穩(wěn)定。分析原因可能是酶主要催化劑的作用，酶添加量較低時，脂肪酶水解程度不夠，當(dāng) TLIM酶質(zhì)量分數(shù)為7%時，酶與文冠果油的接觸已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，催化反應(yīng)趨于穩(wěn)定。因此，最佳TLIM酶添加量是質(zhì)量分數(shù)為7%。

2.4 不同酶解溫度對芥酸含量的影響

在酶催化的過程中，溫度的變化不僅對酶的活性有很大的影響，還會致使反應(yīng)的熱力學(xué)、動力學(xué)過程產(chǎn)生有很大的變化。實驗研究了不同溫度對酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解溫度對芥酸含量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on erucic acid content

圖4顯示，芥酸含量呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢。酶解溫度低于 45 ℃時，隨著酶解溫度的增加，芥酸含量不斷下降，45 ℃時芥酸含量達到最小，當(dāng)溫度超過 45 ℃芥酸含量逐漸上升。原因可能是 Sn-2位羥基與酶形成過度中間態(tài)所需的活化能要遠高于Sn-1(3)位羥基，先增加是由于溫度升高加快了反應(yīng)速率，后減少便是因為酶的選擇性降低，反應(yīng)速率會逐漸降低，芥酸含量逐漸升高。綜上考慮，最佳酶解溫度為45 ℃。

2.5 不同酶解時間對芥酸含量的影響

在催化反應(yīng)的過程中，反應(yīng)時間與芥酸含量密切相關(guān)。本實驗考察了不同反應(yīng)時間對酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶解時間對芥酸含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on erucic acid content

圖5顯示，隨著酶解時間的增大芥酸含量逐漸升高，5 h時達到最小值，隨后逐漸升高。分析原因可能是脂肪酶的水解反應(yīng)和酯化反應(yīng)為可逆反應(yīng)[12]，隨著酶解時間的增加，被水解下來的游離芥酸逐漸升高，與甘油、甘油一酯、甘油二酯發(fā)生酯化反應(yīng)導(dǎo)致文冠果油甘油三酯上結(jié)合的芥酸含量略上升，反應(yīng)平衡被打破，建立起新的平衡。因此，酶解反應(yīng)時間5 h為最佳。

2.6 不同水油摩爾比對芥酸含量的影響

本實驗考察了不同水油摩爾比對酶解文冠果油芥酸含量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 水油摩爾比對芥酸含量的影響Fig.6 Effects of molar ratio of water to oil on erucic acid content

由圖6可知，隨著水油摩爾比的增加芥酸含量逐漸降低后又升高至平穩(wěn)，分析原因可能是脂肪酶的活性中心部位被一個α螺旋的“蓋子”結(jié)構(gòu)所覆蓋，當(dāng)脂肪酶作用于油水反應(yīng)界面時，脂肪酶分子的構(gòu)像發(fā)生變化[13]。α螺旋的“蓋子”打開，催化中心與底物接觸，發(fā)生催化反應(yīng)。當(dāng)水油摩爾比較低時，文冠果油與TLIM脂肪酶的接觸少，大多數(shù)脂肪酶的活性中心沒暴露出來導(dǎo)致反應(yīng)速率低；隨著水油摩爾比的增加，TLIM脂肪酶與文冠果油可以充分接觸，脂肪酶活性中心充分暴露，水解速率就會加快，酶解程度升高，但位置選擇性會變差。綜上考慮，最佳水油摩爾比為30∶1。

2.7 正交實驗結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對酶添加量（A）、反應(yīng)溫度（B）、反應(yīng)時間（C）、水油摩爾比（D）4個因素進行正交實驗，結(jié)果見表2。

由表 2可知，RA＞RB＞RD＞RC可得出酶添加量是影響酶水解法降低芥酸含量的最主因素，各因素對酶水解法降低芥酸含量的影響從強到弱依次是：酶添加量＞反應(yīng)溫度＞水油摩爾比＞反應(yīng)時間。以芥酸含量為考察指標，綜合分析四個因素及三組水平得到最優(yōu)條件應(yīng)為A1B2C2D3：酶添加量為（質(zhì)量分數(shù)）5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間5 h、水油摩爾比為30∶1，得到芥酸含量最低4.86%。

表2 正交實驗直觀表L9(34)Table 2 Intuitive Table of orthogonal experiment L9(34)

2.8 文冠果油酶解后脂肪酸組成

由表 3可知，文冠果油的主要脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、二十碳烯酸、芥酸、神經(jīng)酸。圖7為文冠果油酶解前后氣相色譜對比圖，A為文冠果油色譜圖，B為最優(yōu)條件下酶解產(chǎn)物色譜圖。在固定化脂肪酶TLIM的催化水解下甘油三酯上芥酸含量從酶解前的 8.04%降低酶解后到了 4.86%，且神經(jīng)酸含量保持著 1%左右（酶解后為0.98%）。確定甘油三酯1,3位上的芥酸水解為游離芥酸，導(dǎo)致酸價升高，脫除游離酸后可得到低芥酸文冠果油，具體脫酸工藝實驗室正在研究中。

圖7 文冠果油及其水解產(chǎn)物的氣相色譜圖Fig.7 Gas chromatogram of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil and its hydrolysates

表3 酶解前后文冠果油組成成分Table 3 Components of Xanthoceras sorbifolia Bunge oil before and after enzymatic hydrolysis %

3 結(jié)論

利用脂肪酶對文冠果油中芥酸進行水解，在酶添加量為（質(zhì)量分數(shù)）5%、反應(yīng)溫度45 ℃、反應(yīng)時間5 h、水油摩爾比為30∶1的優(yōu)化工藝條件下，文冠果油甘油三酯上芥酸含量從酶解前的8.04%降低酶解后到了4.86%，芥酸含量降低了約一半，達到了聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織的規(guī)定，同時神經(jīng)酸的含量保持在1%左右，后期通過脫除游離酸可得到合格的低芥酸文冠果油。實驗初步證明了芥酸分布在文冠果油的Sn-1, 3位，固定化脂肪酶 TLIM 能定向水解文冠果油的芥酸，實驗結(jié)果也為低芥酸文冠果油的開發(fā)和工藝路線制定提供了可靠的支持。