王志偉 張自陽 林麗婷 張金文 劉明久 喬 巖

(1河南科技學(xué)院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；3河南師大附中雙語國(guó)際學(xué)校，河南新鄉(xiāng) 453003)

芥酸(erucic acid，C22 ∶1Δ13)屬超長(zhǎng)鏈脂肪酸，是以光合產(chǎn)物蔗糖為主要碳源，通過碳鏈的延長(zhǎng)和去飽和作用形成的[1]。芥酸是制備聚乙烯膜、山崳醇、山崳酸、尼龍、感光材料、乳化劑、香精、潤(rùn)滑油等的原材料，在機(jī)械、化工、冶金、油漆、紡織、橡膠、醫(yī)藥等行業(yè)被廣泛應(yīng)用，是一種重要的工業(yè)原料[2-3]。目前，工業(yè)芥酸主要來源于高芥酸甘藍(lán)型油菜，因此提高油菜中芥酸的含量具有重要意義。同時(shí)，油菜也是植物油的重要來源，其菜籽油食用量占國(guó)內(nèi)食用植物油的57.2%[4]，且菜籽油中的芥酸含量對(duì)于人類的健康具有重要影響。研究表明，菜籽油中的芥酸可能影響菜籽油在人體內(nèi)的消化，引起心肌損傷，使腎上腺組織的膽固醇水平上升，且容易使脂肪在心臟組織中積累，如果長(zhǎng)期食用芥酸含量高的菜籽油，會(huì)增加食用者患心血管類疾病的幾率，因此我國(guó)對(duì)用于食用油的菜籽中芥酸含量的要求是低于1%，而工業(yè)上對(duì)芥酸含量的要求是60%，甚至更高[5-6]。通過雜交選育等傳統(tǒng)育種方法，我國(guó)先后育出了多個(gè)芥酸含量低于1%的食用油菜品種，而育出的高芥酸品種含油量?jī)H40%左右，芥酸含量約為50%，但傳統(tǒng)育種方法局限性較大，芥酸含油量很難再提高[7-8]。因此，利用生物技術(shù)的手段提高芥酸含量已成為油菜高芥酸育種的重要方向[9-10]。

油酸(oleic acid，C18∶1)作為超長(zhǎng)鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸合成的底物，其代謝途徑有2條，一是在原來碳鏈的基礎(chǔ)上在脂肪酸延長(zhǎng)酶1(fatty acid elongation 1，F(xiàn)AE1)作用下繼續(xù)延長(zhǎng)，繼而合成C20∶1、C22∶1等超長(zhǎng)鏈脂肪酸；二是在脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase2，F(xiàn)AD2)作用下繼續(xù)去飽和，從而合成C18∶2、C18∶3等多不飽和脂肪酸。因此提高芥酸的含量一方面可通過提高fae1基因的表達(dá)量，以合成更多的芥酸，另一方面可沉默fad2基因的表達(dá)，減少油酸的去飽和作用，為芥酸的合成提供更多的底物[11]。

人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)是以生物體內(nèi)的miRNA為模板，設(shè)計(jì)一段miRNA及miRNA?序列替換原來前體序列中的miRNA∶miRNA?，從而使新生成的前體序列經(jīng)過剪切作用能夠有目的地對(duì)特定靶基因進(jìn)行沉默。相比傳統(tǒng)沉默基因方式，amiRNA具有高特異性、高效性、高遺傳穩(wěn)定性、高生物安全性等特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于植物的代謝功能、基因功能等相關(guān)研究[12-13]。

芥酸的調(diào)節(jié)研究多是利用傳統(tǒng)的反義抑制、RNAi等手段沉默基因的表達(dá)[14]，而amiRNA在甘藍(lán)型油菜芥酸調(diào)控中的研究尚未見報(bào)道。本研究利用amiRNA技術(shù)，針對(duì)甘藍(lán)型油菜fad2的基因序列設(shè)計(jì)特異的amiRNA，并利用特異性啟動(dòng)子Napin，研究amiRNA對(duì)油菜芥酸合成相關(guān)基因和芥酸含量的調(diào)控，以期為amiRNA在甘藍(lán)型油菜中的應(yīng)用和培育理想芥酸含量的油菜品種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

遺傳轉(zhuǎn)化油菜品種是由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院油菜育種實(shí)驗(yàn)室提供的高芥酸甘藍(lán)型油菜品種MY15(油酸14.38%、亞油酸11.69%、芥酸47.26%)和低芥酸甘藍(lán)型油菜品種 LEA01(油酸 67.36%、亞油酸18.04%、芥酸0.72%)。本試驗(yàn)所用菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌(E.coli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404、pCEPSPS[由pCAMBIA1300載體改造而來，載體內(nèi)的潮霉素(Hyg)抗性被草甘膦(EPSPs)抗性替代]、pCENN(在pCEPSPS的多克隆位點(diǎn)利用EcoRⅠ和KpnⅠ酶切和T4連接酶添加Napin啟動(dòng)子，然后用SalⅠ和HindⅢ酶切連接Nos終止子得到)，pRS300 amiRNA克隆載體。

DNA聚合酶(AP111-01)、克隆載體(CT101-01)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(GF201-01)、氨芐青霉素(GG101-01)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(GF101-01)、卡那霉素(Kanamycin，Kna，GG201-01)、T4 連接酶(FL101-01)、XbaⅠ(JX101-01)、EcoRI(JE201-01)、KpnⅠ(JE201-01)、HindⅢ(JH101-01)、普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒(TIANGEN，DP209)，均購自北京自全式金公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人工miRNA片段的克隆 將Bnfad2(AY577313)的序列提交至amiRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站W(wǎng)MD3，利用pRS300為模板設(shè)計(jì)針對(duì)BnFAD2的專用amiRNA引物(表1)，利用設(shè)計(jì)出的引物進(jìn)行重疊PCR克隆amiRNAD2，各輪反應(yīng)的引物、模板以及產(chǎn)生的片段大小詳見表2，最終獲得的f片段即為目標(biāo)片段。

表1 FAD2的amiRNA引物Table1 The amiRNA primmers of FAD2

表2 重疊PCR各輪反應(yīng)產(chǎn)物及其引物與模板Table2 The production of overlapping PCR and the primmer and template

1.2.2 表達(dá)載體pCENND的構(gòu)建 將重疊PCR獲得的目標(biāo)片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接到PMD-19T載體，利用片段內(nèi)含的KpnⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證并回收，然后將回收目標(biāo)片段利用T4連接酶連接到pCENN載體，組成表達(dá)載體pCENND2，表達(dá)載體經(jīng)EcoRⅠ/KpnⅠ和XbaⅠ/HindⅢ酶切驗(yàn)證無誤后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化。油菜的轉(zhuǎn)化參照Kopertekh等[15]和鄒智[16]的方法，并略作改進(jìn)。

1.2.3 轉(zhuǎn)化陽性株鑒定及種子脂肪酸含量分析 切取無菌培養(yǎng)的油菜幼苗上胚軸和下胚軸作為浸染的外植體，預(yù)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行農(nóng)桿菌的浸染，經(jīng)過愈傷誘導(dǎo)、發(fā)芽、植株發(fā)育和生根，從而發(fā)育成完整植物。在此過程中，在培養(yǎng)基中添加草甘膦，對(duì)愈傷組織的幼芽、幼芽發(fā)育植株及植株生根過程進(jìn)行陽性植株的初步篩選。轉(zhuǎn)化株經(jīng)過草甘膦篩選后，取幼苗葉片提取轉(zhuǎn)化苗葉片DNA作為模板，利用抗除草劑基因EPSPs設(shè)計(jì)特異性引物(表3)，并進(jìn)行定量PCR，然后進(jìn)行陽性株的鑒定。

表3 轉(zhuǎn)化陽性植株檢測(cè)PCR引物Table3 The detect PCR primer for transgenic positive strain

將經(jīng)過鑒定的陽性株移栽至花盆，開花后45 d，待種子接近成熟時(shí)取新鮮的油菜種子，提取種子總RNA，同時(shí)利用近紅外光譜法[17]測(cè)定種子油酸、亞油酸、芥酸的含量。BnFAD2基因的定量分析，以BnEF1基因作為內(nèi)參基因，以未轉(zhuǎn)化的品種中fad2基因的表達(dá)為參照，進(jìn)行相對(duì)定量分析。定量分析所用的引物詳見表4。

表4 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化植株定量引物Table4 The quantification primmer for transgenic Brassica napus

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0軟件對(duì)未轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)化植株相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，檢測(cè)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 amiRNA片段的克隆

利用WMD3設(shè)計(jì)BnFAD2基因amiRNA的特異性引物，以pRS300為模板，經(jīng)過3輪的重疊PCR，每輪利用瓊脂糖凝膠電泳回收，最后可以克隆出amiRNAD2片段，即PCR中的片段f。由圖1可知，片段a略大于250 bp，片段b介于150～200 bp之間，片段c接近300 bp，片段d和e為相同大小的片段，接近于500 bp，而片段f接近750 bp。以上結(jié)果與每個(gè)片段的理論長(zhǎng)度基本相符，即片段a理論長(zhǎng)度為272 bp，片段b理論長(zhǎng)度為171 bp，片段c理論長(zhǎng)度為298 bp，片段d理論長(zhǎng)度為481 bp，片段e理論長(zhǎng)度為481 bp，片段f理論長(zhǎng)度為701 bp，說明克隆的片段是有效的。

2.2 表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切之后，2泳道產(chǎn)生1條略小于500 bp的片段，4泳道為EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的電泳圖，酶切后產(chǎn)生2條片段，1條約1 100 bp，另1條約750 bp，較大的條帶為酶切后的Napin啟動(dòng)子，較小的片段為amiRNAD2＋NOS片段(圖2-A)。因?yàn)樵赼miRNAD2的 5′端和NOS的 3′端各存在一個(gè)HindⅢ的酶切位點(diǎn)(圖2-B)，所以在酶切時(shí)amiRNAE1＋NOS片段作為一個(gè)整體片段被切下，因此其實(shí)際大小應(yīng)該為2個(gè)片段之和，即732 bp。

圖2 pCENND雙酶切驗(yàn)證Fig.2 The verify of pCENND by double digest

2.3 陽性植株的鑒定

以經(jīng)過草甘膦篩選的陽性植株葉片DNA為模板，以EPSPs基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖3可知，陽性植株可擴(kuò)增1條大小約200 bp的條帶，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株則沒有任何條帶，說明表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入陽性植株。

圖3 轉(zhuǎn)化油菜陽性株檢測(cè)Fig.3 The detection of positive tranformed rapeseed

2.4 轉(zhuǎn)化植株fad2基因表達(dá)和脂肪酸組成分析

pCENND2經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染，分別轉(zhuǎn)入了2個(gè)受體材料MY15和LEA01中，并獲得了陽性株，共移栽8株轉(zhuǎn)化株，成活6株，MY15和LEA01分別各成活3株，提取轉(zhuǎn)化株的T0種子和未轉(zhuǎn)化種子的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對(duì)FAD2基因的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。結(jié)果表明，低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株FAD2基因的表達(dá)量極顯著低于未轉(zhuǎn)化的植株，且轉(zhuǎn)化株T0-2的fad2基因的表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3；高芥酸品種MY15的轉(zhuǎn)化株種子fad2表達(dá)量相對(duì)于未轉(zhuǎn)化的植株顯著降低，且轉(zhuǎn)化株T0-2的fad2基因的表達(dá)量顯著低于轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3(圖4)。

圖4 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化植株種子fad2基因表達(dá)Fig.4 The fad2 gene expression in transgenic Brassica napus seeds

由表5可知，高芥酸品種 MY15和低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株種子油酸含量均明顯增加，其中MY15轉(zhuǎn)化株油酸含量極顯著高于CK，而LEA01轉(zhuǎn)化株顯著高于CK。與CK相比，高芥酸品種MY15和低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株種子亞油酸含量均極顯著降低，最大降幅約為17%。轉(zhuǎn)化株芥酸含量均明顯高于CK，高芥酸品種MY15轉(zhuǎn)化株芥酸含量均極顯著高于CK，最高可增加5.12%，最少也增加了3.11%；而低芥酸LEA01轉(zhuǎn)化株芥酸增加的幅度較低，最高只增加了0.45%，最低僅增加了0.16%，且所有材料的芥酸含量均低于1%，僅轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3顯著高于CK。

表5 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化植株種子脂肪酸含量分析Table5 Analysis of fatty acids content of transgenic Brassica napus seed /%

3 討論

目前調(diào)控芥酸的合成主要通過以下3個(gè)途徑:一是使芥酸合成的關(guān)鍵酶基因BnFAE1過表達(dá)，增加芥酸含量，或者沉默該基因表達(dá)，降低芥酸含量，如Katavic等[18]利用擬南芥的FAE1基因轉(zhuǎn)化油菜，芥酸含量提高了8%～10%；淮東欣[19]通過在甘藍(lán)型油菜中超表達(dá)BnFAE1基因，得到了芥酸含量高達(dá)63%的轉(zhuǎn)化植株。二是在油菜中引入外源LPAAT基因，并且將該基因與BnFAE1結(jié)合，從而增加芥酸合成量及其與甘油sn-2位的結(jié)合以提高種子中的芥酸含量，如陳柳等[20]利用LPAAT和KCS基因共轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，低芥酸油菜品種的芥酸含量提高到10.5%，高芥酸油菜品種芥酸含量提高了5%，達(dá)到62.8%；Kanras等[21]利用Ld-LPAAT＋Bn-fae1轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜，得到了芥酸含量高達(dá)72%的轉(zhuǎn)化植株，其后代的芥酸含量也穩(wěn)定在54%左右。三是調(diào)控亞油酸合成的關(guān)鍵酶基因Bnfad2，沉默該基因可以為芥酸合成提供更多的底物，或者過表達(dá)該基因，調(diào)控脂肪酸的組成，本研究通過amiRNA沉默fad2基因的表達(dá)，使芥酸含量顯著提高；Jadhav等[22]通過利用基因沉默技術(shù)RNAi的方式沉默fad2基因，成功地將甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化植株芥酸含量提高了5%～19%；Mietkiewska等[23]利用Hairpin-RNA技術(shù)沉默fad2基因，所獲得的甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化植株后代種子中芥酸含量提高了16%；Loo[24]通過誘變的方式使fad2基因的表達(dá)受到抑制，也成功地提高了轉(zhuǎn)化株種子芥酸含量。但是通過利用這種方式提高芥酸的含量有很大的限制性，其原因在于沉默fad2基因雖然能夠?yàn)榻嫠岷铣商峁└嗟牡孜?，但FAE1基因的表達(dá)沒有顯著提高，造成芥酸的合成能力受到限制，因此高芥酸品種芥酸含量的提高明顯高于低芥酸品種，其原因就是因?yàn)椴煌嫠岷康挠筒似贩NFAE1基因的表達(dá)不同。芥酸的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要各個(gè)方面的配合，按照作物生產(chǎn)上的“源·庫·流”理論，油酸只是芥酸合成的“源”，要想芥酸含量達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，還需要“流”能夠暢通，即合成芥酸的能力需提高，而甘油結(jié)合芥酸的能力為芥酸的“庫”，既提高甘油結(jié)合芥酸的量，才能有效提高芥酸的含量[25]。研究表明，通過調(diào)節(jié)fad2基因的表達(dá)只能單方面提高芥酸含量，要想使芥酸含量達(dá)到80%以上的理想水平，還需要結(jié)合FAE1和LPAAT基因的過表達(dá)，共同組成多元表達(dá)載體[26]。

植物基因調(diào)控轉(zhuǎn)化與外源基因的拷貝數(shù)目、基因整合的染色體位置、遺傳穩(wěn)定性等因素密切相關(guān)[6]，但本研究利用amiRNA技術(shù)避免了以上幾個(gè)因素的影響，amiRNA與傳統(tǒng)的基因沉默方法相比，具有特異性高、沉默效果好、遺傳穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)[6]。其原因在于，首先在amiRNA載體構(gòu)建的過程中，整個(gè)premiRNA序列改變的只有大約21 nt的 miRNA和miRNA?序列，其余的序列則相當(dāng)于植物的內(nèi)源序列，且在植物體內(nèi)不編碼蛋白，從而降低了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問題，其結(jié)構(gòu)與植物內(nèi)源的miRNA具有高度的相似性，該特性決定了amiRNA具有良好的遺傳穩(wěn)定性[27-29]。

與前人研究相比，本研究具有獨(dú)特的優(yōu)越性，同時(shí)由于miRNA和miRNA?的設(shè)計(jì)只針對(duì)Bnfad2基因，既保證了沉默效果，又降低了脫靶的可能性。amiRNAD2沉默fad2基因的沉默效果及轉(zhuǎn)化植株種子內(nèi)脂肪酸含量的變化都說明了amiRNA技術(shù)能夠有效沉默fad2基因的表達(dá)，從而減少油酸的繼續(xù)去飽和生成多不飽和脂肪酸，從而使種子內(nèi)積累更多的油酸，這也為油菜種子內(nèi)脂肪酸成分的調(diào)節(jié)提供了一條有效的途徑。在今后的研究中可以繼續(xù)利用amiRNA技術(shù)對(duì)基因的沉默效果有針對(duì)性地改變種子脂肪酸合成過程中特定基因的表達(dá)，從而有效改變種子內(nèi)脂肪酸的組成，改變其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，進(jìn)一步提高油菜種子的附加值。

amiRNAD2對(duì)轉(zhuǎn)化品種種子內(nèi)fad2基因的沉默效果顯著，但在不同芥酸含量的甘藍(lán)型油菜品種轉(zhuǎn)化株內(nèi)，fad2基因的表達(dá)雖然都下降，但是不同芥酸含量的油菜品種內(nèi)fad2基因下降的幅度是不同的。高芥酸品種降低的相對(duì)較小，而低芥酸品種的降低反而較大，這是因?yàn)楦呓嫠崞贩N內(nèi)fad2基因的表達(dá)量低于低芥酸品種，所以基因沉默的時(shí)候其相對(duì)變化反而小。同時(shí)，不同轉(zhuǎn)化株內(nèi)fad2基因的表達(dá)量是不同的，其表達(dá)差異甚至達(dá)到了顯著水平，這種差異可能是因?yàn)樵谵D(zhuǎn)化過程中，外源基因序列在轉(zhuǎn)入受體材料過程中，插入基因位置的不同而造成。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，amiRNA技術(shù)能夠很好地沉默fad2基因，使得fad2基因的表達(dá)量在高芥酸甘藍(lán)型油菜品種中只有未轉(zhuǎn)化之前表達(dá)量的6.67%～10.00%，其芥酸含量增加了2.11%～5.12%，在低芥酸甘藍(lán)型油菜品種中fad2基因的表達(dá)量降低了30%～50%，芥酸含量增加了0.16%～0.45%；同時(shí)不論高芥酸品種還是低芥酸品種，脂肪酸的組成都發(fā)生了很大的變化，油酸增加 4.99%～10.17%，亞油酸降低 10.71%～16.88%，很好地調(diào)節(jié)了油菜種子內(nèi)脂肪酸的組成。綜上所述，利用amiRNA技術(shù)可有效調(diào)控甘藍(lán)型油菜脂肪酸的組成，提高轉(zhuǎn)化株種子芥酸和油酸的含量，降低亞油酸的含量，改善菜籽油的品質(zhì)，提高菜籽的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。