黨甜甜， 賈 偉， 陳 梅， 潘亞菲， 楊寧愛， 康宇婷，蘇雅靜， 汪澎濤， 趙志軍

（1.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學病原微生物重點實驗室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，銀川 750004）

弓形蟲是一種具有復雜的生命周期，可感染人類和多種溫血動物的專性胞內(nèi)寄生蟲[1]。免疫功能低下的人群感染弓形蟲會引起多種疾病，如HIV、癌癥等，同時會通過胎盤經(jīng)垂直傳播導致孕婦流產(chǎn)[2]。在入侵宿主細胞過程中，弓形蟲的頂端復合體發(fā)揮著重要的作用，而研究最為深入的是其棒狀體，與其發(fā)病機制、宿主細胞入侵和與宿主細胞相互作用等密切相關。棒狀體蛋白（rhoptry proteins，ROP）家族是T.gondii 特異性蛋白，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP8、ROP16 和ROP18 等，其中ROP16 是關鍵的毒力決定因子，可在寄生蟲感染后迅速侵入宿主細胞核[3-5]。巨噬細胞表現(xiàn)出高度的可塑性，根據(jù)刺激信號采取不同的激活狀態(tài)，從而保護組織穩(wěn)態(tài)并調(diào)節(jié)炎性反應，對組織內(nèi)的微環(huán)境因子作出反應。分化為兩種不同的功能表型：M1 型表達誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），主要分泌白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子，M2 型表達精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1），主要分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等抑炎因子[6]。微環(huán)境中的LPS 與巨噬細胞表面TLR4 結(jié)合，作用于核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3），促進巨噬細胞M1 型的極化，分泌促炎因子。Ⅱ型弓形蟲分泌的蛋白會使NF-κB 發(fā)生磷酸化而誘導巨噬細胞偏向M1 型極化[6-8]。信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）受γ 干擾素（γ interferon，IFN-γ）受體刺激后二聚體化，以二聚體的形式進入宿主細胞核中，與編碼iNOS、IL-12 等基因中的序列結(jié)合，調(diào)控M1 型巨噬細胞的極化[8]。

基于以上研究，本研究擬使用大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 作為模型來探討Ⅱ型弓形蟲ROP16對NR8383 巨噬細胞炎性反應的影響。通過構建Ⅱ型弓形蟲ROP16 過表達載體，轉(zhuǎn)染NR8383 細胞后，利用免疫熒光法確定ROP16 在NR8383 細胞中的定位情況，采用RT-PCR、Western blot 和ELISA 檢測相關基因和蛋白表達情況，探討Ⅱ型弓形蟲ROP16 蛋白對NR8383 炎性反應的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

NR8383 細胞保存于寧夏臨床病原微生物重點實驗室；嘌呤霉素購自Sigma 公司；實驗所用慢病毒（空載體pHBLV-CMV 和ROP16 過表達載體pHBLV-CMV ROP16）均購自漢恒生物科技（上海）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa 公司。鼠抗Arg-1 購自美國Proteintech 公司，鼠抗His-tag、兔抗iNOS、HRP 標記山羊抗兔IgG（HRP-IgG）、山羊抗鼠IgG（HRP-IgG）均購自美國Abcam 公司，兔抗NF-κB、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB（phosphorylated nuclear transcription factor κB，P-NF-κB）、STAT1、磷酸化轉(zhuǎn)錄活化蛋白1（phosphorylated transcription activating protein 1，P-STAT1）均購自CST 公司。酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自江萊生物科技有限公司。RT-PCR 所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將NR8383 細胞從-150 ℃冰箱取出后，于37 ℃水浴箱中快速融化，并使用含20% FBS 的F-12K 培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至80%左右時進行傳代，傳代3 次后的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 ROP16 過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構建 將對數(shù)生長期的NR8383 細胞按1×104個/孔接種于96孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液。分組設置為空白對照組（正常NR8383 細胞）、空載組（pHBLVCMV）和ROP16 過表達組（pHBLV-CMV ROP16）。按照說明書，向96 孔板中加入慢病毒，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。之后細胞培養(yǎng)密度達到80%時，用嘌呤霉素（1 μg·mL-1）篩選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，即可用于后續(xù)檢測。

1.2.3 蛋白免疫印跡檢測各組NR8383 細胞相關蛋白的表達 收集細胞密度80%～90%時的空白對照組、空載組、ROP16 過表達組細胞，通過BCA 蛋白提取試劑盒提取全蛋白并檢測相應蛋白濃度。配制7.5%濃縮膠、5%分離膠，根據(jù)蛋白濃度進行上樣，通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃過夜、二抗室溫孵育后，配制顯色液（1∶1），以凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析條帶灰度值，以βactin 作為內(nèi)參。

1.2.4 免疫熒光檢測ROP16 蛋白在NR8383 細胞中的定位 將細胞爬片放置在24 孔板內(nèi)，滴加細胞懸液，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，經(jīng)過細胞固定、打孔以及封閉，加入Mouse monoclonal［HIS.H8］to 6X His tag抗體（Abcam，美國），4 ℃過夜，48 h 后，加入CY3 抗兔熒光二抗，細胞核染色（DAPI），封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 RT-PCR 法檢測各組NR8383 細胞ROP16及相關炎性因子的表達 Trizol 法分別提取空白對照組、空載組及ROP16 過表達組的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR 法檢測相關基因相對表達含量。20 μL 反應體系: cDNA 模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，TB Green Premix EX TaqTMⅡ10 μL，ddH2O 6.4 μL。反應條件: 預變性95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，45 個循環(huán)。采用2－△△Ct法分析目標基因mRNA 水平的相對變化。其中，每組設置3 個平行孔，取平均值，見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.2.6 ELISA 法檢測各組NR8383 細胞培養(yǎng)上清液的炎性因子含量 收集空白對照組、空載組及ROP16 過表達組細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)說明書操作步驟，檢測每組細胞上清液中炎性因子的含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗重復3 次，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達ROP16 慢病毒轉(zhuǎn)染NR8383 細胞結(jié)果

在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空載組和ROP16過表達組均帶有綠色熒光，表明空載組和ROP16過表達組穩(wěn)定株構建成功，見圖1。

圖1 過表達ROP16 慢病毒轉(zhuǎn)染NR8383 細胞熒光表達情況（HE×20）

2.2 轉(zhuǎn)染NR8383 細胞中ROP16 過表達的鑒定

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，ROP16 過表達組ROP16 mRNA 表達高于空白對照組（P<0.01）；Western blot 結(jié)果顯示，ROP16 過表達組中出現(xiàn)單一目的條帶，分子質(zhì)量為96 kDa，符合ROP16蛋白預期大小，即ROP16 蛋白成功表達于NR8383細胞中；空白對照組和空載組中均未出現(xiàn)單一目的條帶，見圖2。

圖2 RT-PCR、Western blot 檢測NR8383 細胞中ROP16 mRNA 及蛋白的表達

2.3 ROP16 蛋白在NR8383 細胞中的定位

免疫熒光結(jié)果顯示，空白對照組和空載組均未出現(xiàn)紅色熒光，ROP16 過表達組出現(xiàn)紅色熒光。融合后發(fā)現(xiàn)ROP16 信號與細胞核重疊，聚集在細胞核中，即ROP16 過表達后定位于NR8383的細胞核中，見圖3。

圖3 免疫熒光確定ROP16 蛋白在NR8383細胞的定位（HE×600）

2.4 相關因子mRNA 及蛋白水平的檢測

RT-PCR 結(jié)果顯示，空白對照組與空載組之間各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P 均>0.05），與空白對照組相比，ROP16 過表達組M1 型關鍵因子iNOS 和CD86 mRNA 的表達均增高（P 均<0.01），而M2 型關鍵因子Arg-1 和CD206 mRNA 的表達均降低（P 均<0.05），見圖4；Western blot 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，ROP16 過表達組iNOS、M1 型 通 路 蛋 白NF-κB、P-NF-κB、STAT1、PSTAT1 蛋白的表達均增高（P 均<0.05），M2 型關鍵分子Arg-1 的表達降低（P<0.05），見圖5。

圖4 RT-PCR 檢測各組NR8383 細胞iNOS、CD86、Arg-1 與CD206 的mRNA 表達

圖5 Western blot 檢測各組NR8383 細胞極化相關蛋白的表達

2.5 RT-PCR 檢測各組NR8383 細胞相關炎性因子的表達

RT-PCR 結(jié)果顯示，ROP16 過表達組中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 mRNA 表達水平均高于空白對照組（P 均<0.01），而抗炎因子TGF-β 和IL-10 mRNA 表達水平均低于空白對照組（P 均<0.01），空白對照組與空載組之間各指標差異均無統(tǒng)計學意義（P 均>0.05），見圖6。

圖6 RT-PCR 檢測各組NR8383 細胞炎性相關因子mRNA 的表達

2.6 ELISA 檢測各組NR8383 細胞上清中相關炎性因子的變化

ELISA 結(jié)果顯示，ROP16 過表達組促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-12 的含量均高于空白對照組（P 均<0.05），而抗炎因子TGF-β 和IL-10的含量均低于空白對照組（P 均<0.05），見圖7。

圖7 ELISA 檢測各組NR8383 細胞上清炎性因子的含量

3 討論

弓形蟲感染后，轉(zhuǎn)化為快速復制的速殖子，在宿主中傳播，引起人獸共患的弓形蟲疾病[9-10]。弓形蟲的分泌蛋白可調(diào)控宿主的免疫反應，具有酪氨酸激酶活性的ROP16 會借助核定位結(jié)構（NLS）轉(zhuǎn)運至宿主細胞核內(nèi)，最終影響宿主細胞的表達[11]。ROP16 可通過調(diào)控因子IFN-γ 誘導NO 的生成，調(diào)控宿主對弓形蟲的抑制作用，還可以通過基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導細胞因子的合成，參與調(diào)控宿主細胞，目前廣泛應用于弓形蟲疫苗的研究[12]。目前關于ROP16 基因過表達大鼠肺泡巨噬細胞的研究報道極少，因此，本文研究ROP16 調(diào)節(jié)大鼠肺泡巨噬細胞極化及其作用機制有積極作用。巨噬細胞根據(jù)對環(huán)境反應的不同，分為經(jīng)典激活的巨噬細胞M1 和替代激活的巨噬細胞M2 兩種不同的表型。M1 型巨噬細胞主要分泌IL-1β、IL-12、IL-6、IL-23、TNF-α 等促炎因子，起促進炎癥的作用；M2 型巨噬細胞主要分泌IL-10、TGF-β、IL-4 等抑炎因子，起抑制炎癥發(fā)生的作用。在正常狀態(tài)下，M1 型細胞分泌的促炎因子與M2 型分泌的抑炎因子處于動態(tài)平衡，以保持體內(nèi)狀態(tài)平衡[13-15]。Jensen 等[16]報道，弓形蟲株有3 個不同的譜系，Ⅰ型和Ⅲ型感染的巨噬細胞使其向M2 型極化偏移，而Ⅱ型感染的巨噬細胞則會向M1型極化偏移。有研究[2，10]結(jié)果顯示，Ⅰ型和Ⅲ型弓形蟲通過替代激活途徑誘導巨噬細胞向M2 型方向極化，而Ⅱ型蟲株誘導M1 型巨噬的極化，且Ⅰ型和Ⅲ型蟲株的替代性激活通過JAK-STAT 信號通路等引發(fā)抗炎，而Ⅱ型菌株對巨噬細胞的經(jīng)典激活則通過激活NF-κB 途徑并引發(fā)促炎。

為研究弓形蟲蛋白ROP16 與巨噬細胞之間的關系，本實驗構建ROP16 過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染至NR8383 巨噬細胞中，結(jié)果顯示，ROP16過表達后向M1 型巨噬細胞偏移，其中iNOS，IL-1β 和TNF-α mRNA 水平與空白對照組和空載組相比增高，而Arg-1、IL-10 及TGF-β mRNA水平的相對表達量則降低。結(jié)合Western blot 和ELISA 實驗結(jié)果，ROP16 過表達后iNOS、NF-κB、P-NF-κB、STAT1、P-STAT1 蛋白表達量增高，Arg-1 蛋白表達量降低，并且細胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α 及IL-12 含量增高，抗炎因子TGF-β及IL-10 含量降低。上述研究結(jié)果說明，NR8383巨噬細胞在ROP16 蛋白作用下可能通過NF-κB信號通路向M1 型極化偏移。通過體外建立巨噬細胞可塑模型，探討弓形蟲分泌蛋白ROP16 對大鼠肺泡巨噬細胞極化的影響，旨在為M1、M2 型炎性反應及一些自身免疫性疾病治療提供新的思路和方法，也為弓形蟲ROP16 對宿主細胞的致病機制研究提供一定基礎，其后應建立動物模型，進一步研究動物體內(nèi)弓形蟲及其效應分子對巨噬細胞極化的影響，并對弓形蟲ROP16 驅(qū)動巨噬細胞向M1 型巨噬細胞偏移的作用機制做更深入研究，為相關疾病的治療提供實驗數(shù)據(jù)的支持，為后續(xù)疾病治療提出建議。

綜上所述，本研究成功構建了Ⅱ型ROP16介導的NR8383 穩(wěn)定細胞系，分析了ROP16 對大鼠肺泡巨噬細胞NR8383 炎性反應的影響，也為弓形蟲ROP16 對宿主細胞的致病機制研究提供了一定基礎。