王 柯， 陳 函， 胡志強， 馬 康， 汪 靜

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏特色中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，銀川 750004； 3.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，銀川 750004）

近年來，癌癥在我國發(fā)病率逐年上升，尤其肺癌的發(fā)病率和病死率均位居榜首[1]。以吉西他濱聯(lián)合順鉑（GP）為主的聯(lián)合化療方案是治療肺癌的主要手段之一[2]，但GP 在殺傷腫瘤細胞的同時，會損傷免疫細胞，且會伴隨一些嚴重的肝、腎和骨髓抑制毒性。因此，探究可防治腫瘤且減輕這些毒副反應(yīng)的輔助治療藥物，對提高患者生存質(zhì)量并延長生存期具有重要的臨床意義。人參皂苷Rg3 是一種人參二醇類四環(huán)三萜皂苷，具有較好的抗癌、抗轉(zhuǎn)移作用[3]。研究[4-5]表明，人參皂苷Rg3 能顯著提高小鼠的免疫功能；且人參皂苷Rg3可抑制腫瘤細胞的增殖，并將腫瘤細胞阻滯于G2期，可有效抑制腫瘤細胞有絲分裂前期蛋白質(zhì)和ATP 的合成。目前，人參皂苷Rg3 與GP 聯(lián)合應(yīng)用對Lewis 肺癌小鼠的抗腫瘤作用以及是否可發(fā)揮增效減毒作用的研究較少?；诖?，本研究通過建立Lewis 肺癌小鼠移植瘤模型，以評估人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 的抗腫瘤作用及增效減毒作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系

小鼠Lewis 肺癌細胞株（LLC）購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，并由寧夏特色中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心保存。

1.2 主要試劑

人參皂苷Rg3 購于上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%，批號：Z10J10X90072）；順鉑購于上海源葉生物科技有限公司（批號：B12J10L 79601）；吉西他濱購于上海源葉生物科技有限公司（批號：T21J8T40183）；MVD 抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號：AH03095376）；CD62P 抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號：AH11156358）；Nrf2（批號：00051701）、NQO1（批號：00056400）、GSTA1（批號：00056400）和HO-1（批號：00063937）抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔二步法檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號：2004B1124）。

1.3 方法

1.3.1 造模與實驗分組 取32 只5～6 周齡雄性C57BL/6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，于小鼠皮下注射狀態(tài)良好的LLC 細胞（密度為5×106個/mL），每只接種0.2 mL，建立小鼠Lewis 肺癌模型。待腫瘤體積增長至約50 mm3時按照平均瘤體隨機分為4 組（n=8）。對照組：每日給予等量生理鹽水；GP 組：吉西他濱第1、8 天腹腔注射，給藥劑量（50 mg·kg-1、0.2 mL），順鉑第1、6、8 天腹腔注射，給藥劑量（5 mg·kg-1、0.2 mL）；人參皂苷Rg3 組：每日灌胃1 次，連續(xù)給藥12 d，給藥劑量（0.8 mg·kg-1、0.2 mL）；聯(lián)合組（人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP）：人參皂苷Rg3 每日灌胃，連續(xù)給藥12 d，給藥劑量（0.8 mg·kg-1、0.2 mL），吉西他濱與順鉑給藥方案與GP 組相同。治療期間，隔天監(jiān)測小鼠體質(zhì)量和腫瘤的長徑a 及短徑b，腫瘤體積（mm3）=a×b2/2；治療結(jié)束后，斷頸處死小鼠，剝瘤及肝、脾、腎。腫瘤生長抑制率=［（對照組腫瘤質(zhì)量-實驗各組腫瘤質(zhì)量）/對照組腫瘤質(zhì)量］×100%。

1.3.2 器官組織和腫瘤組織的HE 染色 各組小鼠器官（肝、脾與腎組織）和腫瘤組織用中性福爾馬林固定24 h，流水沖洗后，石蠟包埋切片，常規(guī)HE 染色，在光鏡下觀察器官和腫瘤組織病理學(xué)改變。

1.3.3 免疫組化法檢測腫瘤組織微血管密度（MVD）、CD62P 和Nrf2 信號通路的表達 瘤體剝離后，切取標本，組織塊經(jīng)10%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，5 μm 厚度連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟、水化，高溫修復(fù)抗原，免疫組化畫圈筆圈住組織，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，孵育后，分別滴加MVD、CD62P、Nrf2、NQO1、GSTA1 和HO-1 抗體（1∶200），4 ℃冰箱孵育過夜。PBS 沖洗，滴加反應(yīng)增強液，PBS 沖洗，滴加增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，PBS 沖洗，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠一般情況的影響

接種LLC 細胞3 d 后，各組小鼠皮下均可觸及綠豆大小結(jié)節(jié)，表明Lewis 肺癌荷瘤小鼠造模成功。給藥后，隨著實驗時間的延長，GP 組小鼠體質(zhì)量持續(xù)下降，進食量及飲水量相對減少，對外界刺激反應(yīng)性下降，自由活動少，毛發(fā)稀疏。對照組、人參皂苷Rg3 組及聯(lián)合組上述癥狀相對較輕，并且小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度增長，聯(lián)合組小鼠體質(zhì)量呈先下降后增長趨勢，人參皂苷Rg3 組小鼠體質(zhì)量增長幅度最為明顯，見圖1。

圖1 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠實體瘤的抑制作用

隨著實驗時間的延長，對照組小鼠腫瘤體積持續(xù)快速增長。與對照組相比，人參皂苷Rg3 組小鼠瘤體積增長緩慢，GP 組和聯(lián)合組小鼠瘤體積增長接近停滯；與對照組相比，GP 組和聯(lián)合組小鼠瘤質(zhì)量均降低（P 均＜0.05）。聯(lián)合組小鼠的腫瘤生長抑制率達84.4%，GP 組為79.7%，人參皂苷Rg3 組小鼠為22.8%；與對照組相比，其余3 組小鼠的腫瘤相對較小，見圖2。

圖2 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠實體瘤的抑制作用

2.3 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠肝、腎、脾和腫瘤病理變化的影響

由圖3 所示，肝組織中，對照組和人參皂苷Rg3 組小鼠肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝細胞形態(tài)正常，細胞核無改變；GP 組小鼠肝細胞排列不均勻，肝細胞出現(xiàn)大量空泡狀脂滴，細胞核發(fā)生固縮；聯(lián)合組小鼠肝細胞脂滴和核固縮減少，病變程度改善。腎組織中，對照組和人參皂苷Rg3 組小鼠可見腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清楚，形態(tài)和染色基本正常；GP 組小鼠腎小球管腔變窄并有少量壞死，腎小管間質(zhì)毛細血管擴張充血；聯(lián)合組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管間質(zhì)毛細血管擴張充血，相對于GP 組病變程度改善。脾組織中，對照組和人參皂苷Rg3 組的小鼠脾組織實質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)分明，藍色白髓、紅色紅髓結(jié)構(gòu)清楚，脾細胞排列規(guī)則，染色均勻；而GP 組小鼠脾組織學(xué)結(jié)構(gòu)紊亂，紅髓、白髓分布不清，細胞排列不規(guī)則；聯(lián)合組小鼠脾組織實質(zhì)結(jié)構(gòu)得以修復(fù)，紅髓和白髓重新形成，脾細胞分布較規(guī)則。腫瘤組織中，與對照組相比，其他3 組小鼠腫瘤細胞均出現(xiàn)不同程度的凋亡，聯(lián)合組小鼠細胞凋亡最為明顯，GP 組次之，人參皂苷Rg3 組較低。

圖3 各組小鼠腎、肝、脾（×20）和腫瘤（×40）的HE 染色圖

2.4 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對CD62P 和MVD的影響

MVD 和CD62P 主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)及胞膜中，陽性染色為棕黃色。對照組小鼠瘤組織微血管大量增生，與對照組相比，人參皂苷Rg3 組、GP 組和聯(lián)合組小鼠腫瘤MVD 均減少（P均<0.05）。與對照組相比，各治療組CD62P蛋白表達均降低（P 均<0.05），見表1、圖4。

圖4 CD62P 和MVD 免疫組化結(jié)果（×40）

表1 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對CD62P 和MVD 的影響

2.5 人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織中Nrf2 信號通路的影響

如圖5 所示，Nrf2、NQO1、GSTA1 和HO-1 主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)及胞膜中，陽性染色為棕黃色。與對照組相比，GP 組上述各蛋白表達均上調(diào)，而聯(lián)合組和人參皂苷Rg3 組上述各蛋白表達均下調(diào)。與GP 組相比，人參皂苷Rg3 組和聯(lián)合組Nrf2、NQO1、GSTA1 和HO-1 蛋白表達均下調(diào)。

圖5 各組小鼠瘤組織中Nrf2 信號通路表達量比較（×40）

3 討論

目前手術(shù)切除是治療肺癌最快、最有效的方法，然而術(shù)后要接受放化療進行鞏固治療，以GP為主的化療方案帶來的毒副反應(yīng)如肝、腎毒性和骨髓抑制等貫穿整個化療過程。因此，中藥復(fù)方及其單體成分聯(lián)合GP 改善肺癌患者術(shù)后生存質(zhì)量目前已成為抗癌研究的熱點。

人參皂苷為人參主要活性成分，其單體按照苷元骨架類型分為三大類，人參皂苷Rg3 為其中一類。已證實人參皂苷Rg3 對腫瘤生長具有抑制作用，其機制是通過各種信號通路影響各種蛋白的表達去誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、分化，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，增強宿主免疫功能等機制而發(fā)揮抗腫瘤作用[6-7]。本研究結(jié)果顯示，GP、人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 對Lewis 肺癌小鼠實體瘤均有抑制作用，其中以人參皂苷Rg3 與GP 聯(lián)合組抗腫瘤作用最明顯，表明人參皂苷Rg3 能提高GP 對腫瘤細胞的殺傷能力；且通過各組小鼠體質(zhì)量變化和各組織HE 染色發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg3 對GP 所致的肝、腎、脾的損傷具有改善作用。

研究[8]顯示，腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移與血管新生密切相關(guān)，當腫瘤組織生長達到1～3 mm 后，需要充足的血管供應(yīng)，因此向腫瘤組織提供氧分與營養(yǎng)并運輸代謝物保證其正常生長，新血管的生成是必要條件[7]。MVD 是目前用以衡量腫瘤新生血管程度的有效指標，腫瘤組織中MVD 的增高預(yù)示瘤體增長速度加快、轉(zhuǎn)移可能性增大。CD62P是位于血小板、血管內(nèi)皮細胞膜上的糖蛋白，其主要配體是PSGL-1 和CD24，主要介導(dǎo)腫瘤細胞與血管內(nèi)皮、血小板的黏附，并在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用[9]。本研究中，各給藥組MVD 均低于對照組，且各治療組CD62P 的表達均低于對照組，與有關(guān)研究[10-14]結(jié)果一致，表明人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 可有效抑制腫瘤新生血管生成。

Nrf2 作為調(diào)控抗氧化的主要因子，為腫瘤細胞中的穩(wěn)定或異常表達創(chuàng)造了有利于腫瘤細胞生存的環(huán)境。當給予腫瘤細胞順鉑后，會觸發(fā)細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。與此同時，胞內(nèi)活性氧升高，Nrf2 會被激活進入細胞核并激活相關(guān)的Ⅱ相解毒酶，如奎寧氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GSTA1）和血紅素加氧酶（HO-1），從而削弱化療藥的“殺”細胞作用，保護細胞生存。在本研究中，GP 組Nrf2、NQO1、GSTA1 和HO-1 蛋白表達均較對照組上調(diào)，人參皂苷Rg3 組與聯(lián)合組上述各蛋白表達均下調(diào)，表明人參皂苷Rg3 聯(lián)合GP 可干預(yù)Nrf2 信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，人參皂苷Rg3 與GP 聯(lián)合后可增強其對Lewis 肺癌小鼠腫瘤生長與腫瘤新生血管生成的抑制作用，且其抑瘤作用可能與干預(yù)Nrf2 信號通路和CD62P 的表達相關(guān)，且人參皂苷Rg3 與GP 聯(lián)用后可起到增效減毒作用。