張映馳， 吳夢(mèng)宇， 李 潔， 單 婧， 史新琛， 徐海明

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

矽肺是塵肺中進(jìn)展最快、危害最嚴(yán)重的一種法定職業(yè)病，是我國(guó)職業(yè)病防治的重點(diǎn)及難點(diǎn)。該病是由長(zhǎng)期吸入含有游離二氧化硅的粉塵引起，其病理特征為肺組織彌漫性纖維化和矽結(jié)節(jié)形成[1]。二氧化硅暴露可以導(dǎo)致職業(yè)人群及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)氧化應(yīng)激失衡及炎性反應(yīng)[2-4]。本課題組前期研究[5]表明，非神經(jīng)元型膽堿能系統(tǒng)（nonneuronal cholinergic system，NNCS）關(guān)鍵分子乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）在矽肺患者外周血血清中顯著降低。另有研究[6]表明，NNCS系統(tǒng)與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）存在較為密切的關(guān)聯(lián)。本研究以源于Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的人源A549 細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，觀察二氧化硅暴露對(duì)該細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎性細(xì)胞因子及NNCS 關(guān)鍵分子AChE酶活性和乙酰膽堿受體（CHRM5、CHRNA7 和CHRNA9）mRNA 表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

在DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清（10%）及青鏈霉素（1%），將其作為A549 細(xì)胞的培養(yǎng)基。細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含0.01% EDTA 的胰蛋白酶（濃度為0.125%）進(jìn)行消化傳代操作，傳代頻率為2～3 d/次。設(shè)置空白組（不接種細(xì)胞，只加相應(yīng)體積的完全培養(yǎng)基）、對(duì)照組（二氧化硅0 μg·cm-2）及二氧化硅暴露組（1、2、4、8 μg·cm-2），暴露時(shí)長(zhǎng)為24 h。

1.2 二氧化硅

二氧化硅購自美國(guó)Sigma 公司（CAS：12173-28-3，孔徑：6～11 nm，SSA：550～600 m2·g-1）。將二氧化硅加入完全培養(yǎng)基中，配制成濃度為50 mg·L-1的二氧化硅儲(chǔ)備液，暴露實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行相應(yīng)的稀釋操作。

1.3 細(xì)胞上清液及裂解液收集

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為8.0×104個(gè)/mL，接種于96 孔板中，接種體積為100 μL/孔。暴露結(jié)束后，在所有的微孔中各加入10 μL 的CCK-8 反應(yīng)液。隨后，將微孔板轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。孵育結(jié)束后，使用多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度值（OD），測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm，使用校正吸光度值（為扣除空白孔OD 值之后的吸光度值）進(jìn)行計(jì)算。

隨后，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，接種于6 孔板中，接種體積為2 mL/孔。暴露結(jié)束后，將細(xì)胞上清液收集至離心管中，用于測(cè)定炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的水平。隨后，加入PBS 洗去多余的培養(yǎng)基，重復(fù)3 次，使用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中。制備細(xì)胞裂解液，用于測(cè)定氧化應(yīng)激指標(biāo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）的水平。需要注意的是，收集細(xì)胞上清液及裂解液過程中使用到的所有實(shí)驗(yàn)材料及試劑均需提前置于冰上預(yù)冷，以保證獲得可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

使用化學(xué)比色法測(cè)定SOD（南京建成生物科技有限公司）及MDA（南京建成生物科技有限公司）水平；使用酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定TNF-α 及IL-6 水平（武漢伊萊瑞特有限公司）；通過改良Ellman 方法測(cè)定AChE 酶活性；使用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞上清液及裂解液中的總蛋白。正式測(cè)定前，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定合理的稀釋倍數(shù)，以保證測(cè)定結(jié)果處于試劑盒的線性測(cè)定范圍之內(nèi)。

1.5 基因表達(dá)水平的測(cè)定

參照分子克隆指南及試劑盒說明書，進(jìn)行樣品中總RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作（引物序列見表1），使用2-△△CT法分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

表1 基因擴(kuò)增引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 二氧化硅暴露對(duì)A549 細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組相比，1、2、4、8 μg·cm-2二氧化硅刺激細(xì)胞24 h 后，對(duì)細(xì)胞活性均無影響（P 均＞0.05），見表2。因此，在后續(xù)的暴露實(shí)驗(yàn)中，選擇上述劑量作為暴露劑量，進(jìn)一步研究二氧化硅所致的毒性效應(yīng)。

表2 二氧化硅刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)細(xì)胞活性的影響（±s）

表2 二氧化硅刺激人肺腺癌A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)細(xì)胞活性的影響（±s）

二氧化硅濃度/（μg·cm-2） n 細(xì)胞活性/%0 6 100.00±3.77 1 6 99.27±3.32 2 6 101.43±2.48 4 6 97.96±4.30 8 6 95.23±3.88

2.2 二氧化硅暴露對(duì)A549 細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子水平的影響

與對(duì)照組相比，4、8 μg·cm-2暴露組細(xì)胞裂解液中SOD 活性下降（P 均＜0.05），8 μg·cm-2二氧化硅暴露組細(xì)胞上清液中TNF-α 含量升高了9.8%（P＜0.05）；4、8 μg·cm-2二氧化硅暴露組細(xì)胞上清液中IL-6 含量分別升高了18.1%和37.7%（P 均＜0.05），見表3。

表3 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子水平的影響（±s）

表3 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子水平的影響（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05。

二氧化硅濃度/（μg·cm-2） n SOD/（U·mgprot-1） MDA/（pmol·mgprot-1） TNF-α /（ng·L-1） IL-6/（ng·L-1）0 3 41.76±1.28 80.20±4.07 798.66±30.81 42.88±0.31 1 3 37.46±2.95 81.43±2.44 779.33±26.43 45.13±1.96 2 3 37.11±2.57 79.38±4.56 821.09±8.48 45.27±2.91 4 3 20.96±2.01* 83.27±1.27 807.17±21.90 50.62±2.10*8 3 20.11±3.92* 85.66±2.06 877.29±10.83* 59.04±4.58*

2.3 二氧化硅暴露對(duì)A549 細(xì)胞內(nèi)AChE 酶活性的影響

與對(duì)照組相比，1、2、4 μg·cm-2二氧化硅暴露劑量下細(xì)胞裂解液中AChE 酶活性無變化（P均>0.05）。隨著暴露劑量的進(jìn)一步升高，8 μg·cm-2暴露組細(xì)胞裂解液中AChE 酶活性較對(duì)照組降低了40.7%（P＜0.05），見表4。

表4 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)AChE活性的影響（±s）

表4 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)AChE活性的影響（±s）

與對(duì)照組比較*P<0.05。

二氧化硅濃度/（μg·cm-2） n AChE 活性（U/104cell）0 3 17.65±1.02 1 3 17.43±0.97 2 3 17.49±0.78 4 3 16.23±1.35 8 3 10.47±0.41*

2.4 二氧化硅暴露對(duì)A549 細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿受體mRNA 的表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，4、8 μg·cm-2二氧化硅暴露組CHRM5 及CHRNA7 mRNA 表達(dá)水平均降低，8 μg·cm-2暴露劑量下CHRNA9 mRNA 表達(dá)水平升高（P 均＜0.05），見表5。

表5 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)乙酰膽堿受體mRNA 表達(dá)量的影響（±s）

表5 二氧化硅刺激A549 細(xì)胞24 h 后對(duì)乙酰膽堿受體mRNA 表達(dá)量的影響（±s）

與對(duì)照組比較*P<0.05。

二氧化硅濃度/（μg·cm-2） n CHRM5 CHRNA7 CHRNA9 0 3 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1 3 0.96±0.22 1.06±0.04 1.20±0.13 2 3 1.37±0.29 1.03±0.09 1.15±0.28 4 3 0.61±0.12* 0.71±0.12* 1.24±0.15 8 3 0.55±0.27* 0.32±0.09* 2.44±0.24*

3 討論

機(jī)體氧化-抗氧化平衡對(duì)維持正常的生物學(xué)功能起著重要作用，外源刺激會(huì)打破該平衡，導(dǎo)致體內(nèi)ROS 的過量蓄積并誘發(fā)多種疾病的發(fā)生。SOD 是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，其含量隨著接觸粉塵的增多以及時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消耗。MDA 含量是反映生物有機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù)，可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度，也能間接反映組織過氧化損傷程度[7-9]。在本研究中，二氧化硅刺激A549 細(xì)胞后，SOD 水平下降，MDA 含量未發(fā)生變化，提示二氧化硅暴露從一定程度上影響了A549 細(xì)胞內(nèi)的氧化-抗氧化平衡。

TNF-α 是一種涉及系統(tǒng)性炎癥的細(xì)胞因子，同時(shí)也是屬于引起炎性反應(yīng)的眾多細(xì)胞因子中的一員。TNF-α 由1 型輔助性T 細(xì)胞（Th1）分泌，可以誘導(dǎo)炎性細(xì)胞的吸附，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和成纖維細(xì)胞增殖[10]。IL-6 是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，在塵肺的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抗炎、促炎、致纖維化等多種作用[11]。在本研究中，二氧化硅刺激A549 細(xì)胞后，上清液中TNF-α 和IL-6 水平均出現(xiàn)不同程度的升高，提示外源性二氧化硅可以誘導(dǎo)A549 細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

NNCS 系統(tǒng)包括AChE、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）、膽堿酯酶（ChE）、毒蕈堿型乙酰膽堿能受體（mAChR）和煙堿膽堿能受體（nAChR），在生物體內(nèi)廣泛存在。一方面，該系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)有機(jī)體的正常生理功能。另一方面，還與一些疾病的病理變化相關(guān)[12-13]。有研究[14-15]表明，乙酰膽堿受體激動(dòng)劑卡巴膽堿作用于A549 細(xì)胞可以促進(jìn)EMT 過程。在本研究中，二氧化硅暴露可引起A549 細(xì)胞中AChE 酶活性下降，同時(shí)影響乙酰膽堿受體CHRM5、CHRNA7 和CHRNA9 的mRNA表達(dá)水平。上述結(jié)果提示，二氧化硅暴露可能通過影響NNCS 關(guān)鍵分子AChE 及乙酰膽堿受體的水平，進(jìn)而影響A549 細(xì)胞的EMT 過程。

綜上所述，二氧化硅暴露可以影響人肺腺癌A549 細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，同時(shí)影響與EMT 密切相關(guān)的NNCS關(guān)鍵分子AChE 酶活性及乙酰膽堿受體mRNA的表達(dá)水平。本研究結(jié)果為深入理解二氧化硅所致的毒性效應(yīng)及機(jī)制提供了一個(gè)新的視角。