王寶禎， 凌 珺， 陳 靜， 李 濤

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤外二科，銀川 750004）

乳腺癌是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是三陰性乳腺癌預(yù)后較差的主要原因之一。其中侵襲和轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1-3]，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中腫瘤細(xì)胞離開(kāi)原發(fā)腫瘤病灶，侵入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)入遠(yuǎn)處器官并形成轉(zhuǎn)移灶[4]。人類(lèi)的大多數(shù)實(shí)體瘤都起源于上皮細(xì)胞，經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，啟動(dòng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞失去黏附特性和極性，并獲得遷移和侵襲的能力[5-7]。研究[8-10]顯示，IL-6/STAT3、TGF-β/smad、PI3K/AKT 等信號(hào)通路都參與了乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程，且組蛋白乙?；腿ヒ阴；氖д{(diào)與癌癥進(jìn)展有關(guān)[11-12]。在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型和體內(nèi)腫瘤移植模型中發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿℉DACis）可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化和細(xì)胞周期阻滯[13-15]。目前，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的臨床試驗(yàn)中，LBH589、丙戊酸和MS-275 表現(xiàn)出良好的低毒抗腫瘤活性，但其副反應(yīng)較為明顯，因此，有必要尋找新的HDACis 用于乳腺癌的臨床治療[16]。Prinostat（SB939）是一種新型的口服HDACis，與其他抑制劑如Vorinostat（SAHA）相比，具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)、理化和藥學(xué)特性[17]?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)利用生物信息學(xué)手段，分析SB939 抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞相應(yīng)基因表達(dá)的改變，尋找其作用的關(guān)鍵基因及相關(guān)重要通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），低溫離心機(jī)（4 ℃）（Eppendorf 公司），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司），NanodropR2000（Thermo Fisher 公司），ABI 9700 RCR 儀（ABI 公司），GeneChipR Hybridization Oven 645（Thermo Fisher 公司），GeneChipR Fluidics Station 450（Thermo Fisher 公司），GeneChipR Scanner 3000 7G（Thermo Fisher 公司）。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 三陰性乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231（ATCC），RPMI-1640 培養(yǎng)基（MultiCell Technologies 公司），胎牛血清（MultiCell Technologies公司），SB939（Selleck 化學(xué)公司），TRIzol（Ambol公司），總RNA 提取試劑盒（Macherey-nagel 公司），3’IVT PLUS 試劑盒（Affymetrix 公司），GeneChipR雜交、洗滌和染色試劑盒（Affymetrix 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA 提取和純化

三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 用含有20%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度的SB939（0、40、60 μmol·L-1）處理24 h，將收集的細(xì)胞分為對(duì)照組C（未經(jīng)SB939 處理的3 個(gè)對(duì)照組C1、C2、C3）及6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組T（經(jīng)40 μmol·L-1的SB939 處理的3 個(gè)低劑量組T1、T2、T3，以及 經(jīng)60 μmol·L-1的SB939 處理的3 個(gè)高劑量組T4、T5、T6）。當(dāng)細(xì)胞貼壁程度達(dá)到85%～90%后，用PBS 洗3 遍，加入TRIzol，反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞。隨后加入氯仿，室溫靜置15 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，加入異丙醇，靜置10 min，再次4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，75%乙醇洗滌沉淀，離心，室溫靜置5 min。加入DEPC 處理水溶解RNA，-70 ℃保存。提取總RNA 的濃度和質(zhì)量，采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，總RNA 純化的詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照3’IVT PLUS 試劑盒要求操作。

1.3 芯片雜交

芯片采用Affymetrix 公司提供的表達(dá)譜芯片進(jìn)行分析，實(shí)際操作流程參照Affymetrix 表達(dá)譜芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。cRNA 片段化處理后，加入GeneChipR雜交、洗滌染色試劑盒內(nèi)提供的雜交液，將混勻的雜交液滴加在芯片上處理過(guò)夜。芯片雜交后的洗滌、染色等過(guò)程嚴(yán)格按照GeneChipR 提供的操作手冊(cè)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Affymetrix 官方軟件Expression Console進(jìn)行芯片QC 質(zhì)檢，并利用Bioconductor 項(xiàng)目中的affy、oligo、gcrma 與limma 包進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)分析。使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)GO（gene ontology）功能富集及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集對(duì)差異基因進(jìn)行分析。GO 功能富集主要對(duì)差異的基因進(jìn)行功能類(lèi)別或者細(xì)胞定位分析。將上調(diào)和下調(diào)的基因分別經(jīng)過(guò)GO功能富集后，紅色表示上調(diào)的基因所富集的GO條目，綠色表示下調(diào)的基因所富集的GO 條目，柱形越長(zhǎng)表示富集越顯著。KEGG 通路富集分析：藍(lán)色柱狀圖以Enrichment Score 為參數(shù)展示富集最顯著的前10 條通路條目的情況，柱形越長(zhǎng)表示富集越顯著。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

差異基因火山圖以倍數(shù)差異（log fold change）為x 軸，P 值為y 軸，并以灰色粗線標(biāo)示倍數(shù)差異與顯著性的閾值，將過(guò)檢的下調(diào)基因標(biāo)示為綠色，上調(diào)基因標(biāo)示為紅色。右上角添加moderated-t的觀測(cè)值分布與理論分布的QQ 圖，用以標(biāo)注假陽(yáng)性控制情況。

GSEA 分析的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于MSigDB v5.1，color bar 代表檢出表達(dá)基因的數(shù)目，紅色對(duì)應(yīng)上調(diào)倍數(shù)，藍(lán)色對(duì)應(yīng)下調(diào)倍數(shù)，黑色線條表示對(duì)應(yīng)位置的基因，綠色曲線代表所檢測(cè)基因?qū)?yīng)的Enrichment Score 分布（分?jǐn)?shù)為負(fù)值，說(shuō)明該靶基因在下調(diào)基因中富集；分?jǐn)?shù)為正值，說(shuō)明該靶基因在上調(diào)基因中富集）。

2 結(jié)果

2.1 差異基因表達(dá)分析

高劑量組（T4～T6）與對(duì)照組（C1～C3）相比，基因表達(dá)上調(diào)1.5 倍的基因共19 個(gè)，下調(diào)1.5 倍的mRNA 基因92 個(gè)，芯片雜交分析后的差異基因火山圖如圖1A 所示，越偏離中心兩條線的點(diǎn)，代表此基因在高劑量組和對(duì)照組的差異越明顯。從差異基因聚類(lèi)熱圖（圖1B）可以看出，下調(diào)的基因包括SOX4、HAS2 等，上調(diào)的基因包括IFIT1、IFIT2 等。

圖1 差異基因的表達(dá)

2.2 GSEA 分析

GSEA 分析數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因集做了如H（hallmark gene sets）、C1（positional gene sets）、C2_CP（Canonical pathways）、C3_MIR（microRNA targets）等13 組分類(lèi)，本研究著重分析了C3_MIR 組（共221 個(gè)），主要用于鑒定表達(dá)差異是否可能由miRNA 引起。結(jié)果顯示在經(jīng)過(guò)SB939 處理后的三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 中（圖2），miR-501、miR-23A、miR-23B 在下調(diào)的miRNA 中顯著富集（ES 值分別為-0.34 和-0.26）。

圖2 GSEA 分析結(jié)果

2.3 GO 富集分析

在生物過(guò)程（biological process，BP）上調(diào)的DEGs 主要富集在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路及對(duì)卵泡刺激反應(yīng)、促性腺激素反應(yīng)等；下調(diào)的DEGs 顯著富集在唾液腺形態(tài)發(fā)生發(fā)展、二歧性上皮末端單元的再分裂、器官形態(tài)發(fā)生及骨形成（圖3）。在分子功能（molecular function，MF）上，上調(diào)的DEGs 富集絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、氧化還原酶活性、絲氨酸型肽酶活性等，下調(diào)的DEGs 富集在受體結(jié)合、蛋白結(jié)合、RNA 聚合酶2 核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性參與轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控等（圖4）。細(xì)胞組成（cellular component，CC）分析顯示，上調(diào)的DEGs 顯著富集于細(xì)胞溶質(zhì)、胞質(zhì)部分和有絲分裂器等；下調(diào)的DEGs 顯著富集于細(xì)胞外空隙、血小板α 顆粒管腔和肌動(dòng)蛋白絲等（圖5）。

圖3 BP 的GO 富集分析

圖4 MF 的GO 富集分析

圖5 CC 的GO 富集分析

2.4 KEGG 通路分析

下調(diào)DEGs 通路主要富集于上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲途徑、磷酸肌醇代謝、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)和ECM-受體相互作用途徑，（圖6）。

圖6 KEGG 通路分析

3 討論

乳腺癌是當(dāng)今女性發(fā)病率和病死率最高的一種惡性腫瘤，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和病死率處于逐年上升的趨勢(shì)[18-19]。其中，三陰性乳腺癌發(fā)生早期轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，由于其過(guò)早發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此，三陰性乳腺癌治療方式主要以化學(xué)藥物治療為主。但隨著靶向治療在臨床的應(yīng)用，基因靶點(diǎn)的確定成為目前的研究熱點(diǎn)。臨床常用的組蛋白去乙?；敢种苿┧幬锇ū焖岷蚆S-275 等[20-22]。Prinostat（SB939）可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[23-26]。為了進(jìn)一步研究SB939抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，本研究通過(guò)設(shè)置SB939 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)其進(jìn)行基因芯片分析。

本研究通過(guò)基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，在所有差異表達(dá)的基因中，有19 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，92 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO 富集分析顯示，上調(diào)的DEGs 主要富集在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、對(duì)卵泡刺激和促性腺激素反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；在分子功能上，上調(diào)的DEGs主要與絲氨酸型肽鏈內(nèi)切酶活性、氧化還原酶活性和絲氨酸型肽酶活性相關(guān)；細(xì)胞成分分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs顯著富集于細(xì)胞溶質(zhì)、胞質(zhì)部分和有絲分裂器等部位。下調(diào)的DEGs 在生物學(xué)過(guò)程主要富集在唾液腺形態(tài)發(fā)生發(fā)展、二歧性上皮末端單元的再分裂、器官形態(tài)發(fā)生和骨形成；在分子功能上，下調(diào)的DEGs 富集在受體結(jié)合、蛋白結(jié)合、RNA 聚合酶2 核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性參與轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控等；細(xì)胞成分分析結(jié)果顯示，下調(diào)的DEGS 顯著富集于細(xì)胞外空隙，血小板α 顆粒管腔，肌動(dòng)蛋白絲等。KEGG通路富集分析中結(jié)果顯示，下調(diào)DEGs 通路主要富集于上皮細(xì)胞的細(xì)菌侵襲途徑，磷酸肌醇代謝，磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)，ECM-受體相互作用途徑。

miRNA 在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著非常重要的作用[27]，而這些基因又可能與特定的生物過(guò)程有關(guān)。多數(shù)miRNA 控制的基因鄰域參與如動(dòng)力蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)過(guò)程、免疫反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞因子活性和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及EMT 途徑，在ER 陰性的乳腺癌腫瘤組織以及相應(yīng)的細(xì)胞系中其異常升高導(dǎo)致了乳腺癌細(xì)胞的增殖[28-31]。miR-501 的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如它可以激活Wnt/β-catenin 信號(hào)進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[32-37]。miR-23A 和miR-23B 是miR-23 兩種亞型。miR-23A 的過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[38-40]，一方面miR-23A 可通過(guò)阻斷TGF-β1 介導(dǎo)的EMT，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。另一方面可以直接靶向上皮標(biāo)志物基因CDH1，降低E-cadherin 的表達(dá)，從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)[40]。GSEA 分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)高劑量（T4～T6）處理后，miR-501、miR-23A、miR-23B 等在表達(dá)下調(diào)的miRNA 中顯著富集，即可表明SB939 可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，其發(fā)揮作用的途徑可能是多樣的。

綜上所述，HDACis SB939 具有抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用，可通過(guò)多種途徑為三陰性乳腺癌的深入研究提供探索方法，也為三陰性乳腺癌的臨床治療提供了參考依據(jù)。