陶宏宇， 孫 楠， 朱 珊， 申洪遠(yuǎn)， 米成嶸， 王福霞， 王 文

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院超聲科，銀川 750004）

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。作為最易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤，乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)分期對于后續(xù)的治療及預(yù)后有著重要意義[2]。前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）是原發(fā)腫瘤引流區(qū)的第一個或第一組淋巴結(jié)，目前臨床多采用前哨淋巴結(jié)活檢（sentinel lymph node biopsy，SLNB）來判定其病理狀況，但其本身為有創(chuàng)檢查并且操作難度較高[3]。近年來，超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）作為一種無創(chuàng)且簡便的檢查手段，被越來越多地應(yīng)用于乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)中，通過注射超聲微泡造影劑可獲得淋巴結(jié)內(nèi)微血管分布及灌注信息，從而對SLN 狀態(tài)進(jìn)行判斷[4]。本研究構(gòu)建了Balb/c 小鼠乳腺癌細(xì)胞足墊成瘤的腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，觀察比較腘窩淋巴結(jié)在常規(guī)超聲以及經(jīng)靜脈注射造影劑后CEUS 的表現(xiàn)，探討CEUS 在小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞株

健康Balb/c 小鼠50 只，均為雌性，鼠齡4周，體質(zhì)量18～20 g/只，購于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，在SPF 級環(huán)境中飼養(yǎng)。小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1 的復(fù)蘇與培養(yǎng)

從液氮中將凍存的小鼠4T1 乳腺癌細(xì)胞取出，迅速放入37 °C 水浴鍋中復(fù)蘇，復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在37 °C、5%CO2環(huán)境下進(jìn)行體外培養(yǎng)增殖，培養(yǎng)皿中細(xì)胞長至80%密度則進(jìn)行傳代，細(xì)胞傳代三代以上后取對數(shù)生長期細(xì)胞配制成腫瘤細(xì)胞懸液。

1.3 構(gòu)建Balb/c 小鼠腘窩淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移模型

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取對數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞，加入PBS 溶液稀釋，配制成濃度約為1×107個/mL 的腫瘤細(xì)胞懸液。實(shí)驗(yàn)前對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)編號，消毒小鼠右后腿足墊皮膚，使用1 mL 注射器將腫瘤細(xì)胞懸液（約60 μL/只）注射入足墊皮下，隆起皮丘后緩慢退針。之后定期觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、足墊腫瘤生長情況以及同側(cè)腘窩淋巴結(jié)腫大情況，腫瘤體積計(jì)算公式為：體積（mm3）=（長×寬2）/2，根據(jù)計(jì)算結(jié)果繪制腫瘤時(shí)間生長曲線。在注射腫瘤細(xì)胞懸液后第2、3、4、5、6 周分別隨機(jī)抽取10 只小鼠進(jìn)行常規(guī)超聲及CEUS 檢查。

1.4 常規(guī)超聲檢查

使用西門子ACUSON Sequoia 彩色多普勒超聲診斷儀，10 L4 線陣探頭，檢測頻率10 MHz，實(shí)驗(yàn)中儀器各項(xiàng)參數(shù)保持不變。采用異氟烷吸入麻醉小鼠，取仰臥位固定于操作臺上，超聲耦合劑加熱到適宜溫度后使用，操作全程注意小鼠麻醉狀態(tài)的監(jiān)護(hù)及保暖。

使用常規(guī)超聲掃描小鼠右后腿足部及同側(cè)腘窩，充分顯示足墊腫瘤及腘窩腫大淋巴結(jié)。觀察腫瘤內(nèi)部回聲、有無液性暗區(qū)，在最佳成像切面測量淋巴結(jié)縱徑及橫徑，觀察記錄淋巴結(jié)回聲、縱橫比、邊緣及淋巴門狀況等，彩色多普勒血流顯像（color doppler flow imaging，CDFI）觀察腫瘤及淋巴結(jié)血流情況。檢查完畢儲存靜態(tài)圖像，切換進(jìn)入造影模式。

1.5 CEUS 及造影圖像分析

超聲造影劑選用意大利Bracco 公司的第二代微泡造影劑聲諾維（SonoVue），將5 mL 0.9%NaCl 溶液與凍干粉混合后搖勻備用。在超聲診斷儀上選擇造影條件為SonoVue 專用模式，以團(tuán)注方式對每只小鼠經(jīng)眶后靜脈叢注射0.1 mL 造影劑，注射后即刻開啟儀器內(nèi)置計(jì)時(shí)器，儲存計(jì)時(shí)開始后5 min 內(nèi)的造影影像。

對淋巴結(jié)造影增強(qiáng)模式進(jìn)行分析，根據(jù)造影劑灌注淋巴結(jié)的模式可分為離心性增強(qiáng)以及向心性增強(qiáng)，根據(jù)到達(dá)增強(qiáng)峰值時(shí)淋巴結(jié)內(nèi)造影劑的分布情況，可將腘窩淋巴結(jié)造影劑分布模式分為四類，即Ⅰ型：整體均勻增強(qiáng)，Ⅱ型：整體不均勻增強(qiáng)，Ⅲ型：僅周邊環(huán)狀增強(qiáng)，Ⅳ型：整體不增強(qiáng)或僅局部低增強(qiáng)。所有超聲操作及診斷工作均為兩名從事超聲造影5年以上的臨床醫(yī)生共同完成。

1.6 病理檢查

造影結(jié)束后，在深度麻醉下行頸部脫臼處死小鼠，解剖小鼠足墊腫瘤及同側(cè)腫大腘窩淋巴結(jié)浸入4%多聚甲醛組織固定液中，之后包埋入石蠟，進(jìn)行HE 染色，光鏡下由專業(yè)病理科醫(yī)師觀察診斷。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，計(jì)算常規(guī)超聲與聯(lián)合經(jīng)靜脈CEUS 的診斷準(zhǔn)確度、特異度和靈敏度，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足墊腫瘤生長情況

足墊接種腫瘤細(xì)胞懸液后4～5 d，50 只小鼠右后腿足墊處均可觀察到有腫瘤結(jié)節(jié)長出，成瘤率100%（50/50）。足墊腫瘤體積隨時(shí)間增加而逐漸增大，在接種后不同時(shí)間測量腫瘤大小，其時(shí)間生長曲線見圖1。從接種第3 周開始，部分小鼠腫瘤表面開始出現(xiàn)潰爛、發(fā)黑，至接種后第6 周的超聲檢查前，所有剩余小鼠的腫瘤均出現(xiàn)程度不等的表面潰爛。

2.2 小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況

足墊接種腫瘤細(xì)胞懸液后1 周左右，50 只小鼠均可觸及腫瘤同側(cè)腘窩處米粒大小的腫大淋巴結(jié)。于接種后第2、3、4、5、6 周分別隨機(jī)抽取10 只小鼠，在CEUS 檢查后處死并解剖腘窩淋巴結(jié)進(jìn)行HE 染色病理診斷，小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況見圖1。

圖1 足墊腫瘤的時(shí)間生長曲線及不同時(shí)間點(diǎn)腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率

2.3 常規(guī)超聲表現(xiàn)

常規(guī)超聲顯示，小鼠足墊原始腫瘤呈低回聲，自接種第3 周開始，觀察到部分瘤體內(nèi)存在大小不等的液性暗區(qū)（提示存在液化壞死），CDFI 可見腫瘤內(nèi)點(diǎn)狀分布的血流信號。在常規(guī)超聲下，反應(yīng)性增生淋巴結(jié)典型表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)均勻低回聲，縱橫比＞2，CDFI 可見淋巴門型血流或無血流信號。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)典型表現(xiàn)為實(shí)質(zhì)回聲不均勻，形狀呈類圓形，縱橫比＜2，邊緣不規(guī)則，淋巴門消失，CDFI 顯示血流信號沿淋巴結(jié)周邊散在分布，或表現(xiàn)為周邊及淋巴門型血流同時(shí)存在，見表1。

表1 腘窩淋巴結(jié)常規(guī)超聲表現(xiàn)（例）

2.4 經(jīng)靜脈CEUS 及病理表現(xiàn)

經(jīng)眶后靜脈叢注射造影劑后，足墊腫瘤即刻出現(xiàn)造影劑充盈，注射后3～5 s，腘窩腫大淋巴結(jié)處可觀察到造影劑充盈，20 s 左右達(dá)到充盈峰值，之后造影劑開始緩慢消退。在常規(guī)超聲檢查的基礎(chǔ)上，根據(jù)淋巴結(jié)造影劑灌注增強(qiáng)模式以及到達(dá)充盈峰值時(shí)淋巴結(jié)內(nèi)造影劑的分布模式對淋巴結(jié)良惡性進(jìn)行判斷；轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)在顯像過程中造影劑灌注增強(qiáng)模式多為向心性增強(qiáng)，反應(yīng)性增生淋巴結(jié)多為離心性增強(qiáng)（P＜0.05），轉(zhuǎn)移性與反應(yīng)性增生淋巴結(jié)造影劑分布模式差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)造影劑多呈不均勻分布且整體強(qiáng)度較低，造影劑分布模式多為Ⅱ型、Ⅲ型或Ⅳ型，見圖2B；病理HE 染色切片顯示，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)表現(xiàn)為淋巴結(jié)正常形態(tài)消失，內(nèi)部淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，可見腫瘤細(xì)胞浸潤并取代正常淋巴組織，見圖2C。反應(yīng)性增生淋巴結(jié)多為整體均勻高增強(qiáng)，造影劑分布模式多為Ⅰ型，見圖3B。反應(yīng)性增生淋巴結(jié)的形態(tài)較正常，淋巴結(jié)內(nèi)可見生發(fā)中心，無腫瘤細(xì)胞浸潤，見圖3C。

圖2 典型轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)聲像圖及病理表現(xiàn)

圖3 典型反應(yīng)性增生淋巴結(jié)聲像圖及病理表現(xiàn)

表2 腘窩淋巴結(jié)經(jīng)靜脈CEUS 表現(xiàn)［例（%）］

2.5 常規(guī)超聲與聯(lián)合經(jīng)靜脈CEUS 對小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的診斷比較

在連續(xù)5 周分別解剖取出的50 只小鼠的50枚腫大腘窩淋巴結(jié)中，病理診斷32 枚為轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，18 枚為反應(yīng)性增生淋巴結(jié)。以病理檢查結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)超聲對小鼠腘窩淋巴結(jié)良惡性的診斷準(zhǔn)確度為56.0%，靈敏度為56.3%，特異度為55.6%；聯(lián)合經(jīng)眶后靜脈叢CEUS 對小鼠腘窩淋巴結(jié)良惡性的診斷準(zhǔn)確度為76.0%，靈敏度為75.0%，特異度為77.8%，見表3。兩種超聲檢查方式對小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型良惡性鑒別的準(zhǔn)確度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.456，P＜0.05），而靈敏度與特異度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.096，P=0.275，采用Fisher 確切概率法）。

表3 常規(guī)超聲及聯(lián)合經(jīng)靜脈CEUS 檢查與病理診斷結(jié)果比較

3 討論

SLN 作為阻止腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴道擴(kuò)散的屏障，其狀態(tài)對于乳腺癌患者癌癥分期以及后續(xù)治療決策具有重要意義。在臨床上，SLNB 是判定淋巴結(jié)性質(zhì)的金標(biāo)準(zhǔn)，通過藍(lán)色染料法和核素探測法標(biāo)記淋巴結(jié)后進(jìn)行SLNB 可得出對SLN 狀態(tài)較精準(zhǔn)的結(jié)果[5]。在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴道的轉(zhuǎn)移以及腫瘤本身所引起的炎性反應(yīng)均有可能引起SLN 的腫大，腫瘤引流區(qū)的非轉(zhuǎn)移性腫大淋巴結(jié)被稱為腫瘤反應(yīng)性淋巴增生[6]，如何早期發(fā)現(xiàn)腫大淋巴結(jié)并對其進(jìn)行無創(chuàng)鑒別診斷依然是目前外科及影像專業(yè)所面臨的難題。

本次實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了4T1 乳腺癌細(xì)胞小鼠足墊成瘤的腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，腘窩淋巴結(jié)是小鼠足掌區(qū)的第一站引流淋巴結(jié)，形成的單向淋巴道轉(zhuǎn)移模型具有轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于單純的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移研究[7]。接種后1周，腘窩淋巴結(jié)腫大至米粒大小，觸之質(zhì)地較硬，可隨皮膚滑動，隨著時(shí)間發(fā)展至接種后3 周左右，一部分反應(yīng)性增生淋巴結(jié)較之前稍減小，但與對側(cè)相比依然處于腫大狀態(tài)，而轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)內(nèi)癌灶不斷生長，隨著時(shí)間增長淋巴結(jié)繼續(xù)增大，甚至縱徑可超過1 cm。

二維超聲以及彩色多普勒超聲是臨床檢查淋巴病變的常規(guī)方法，但單獨(dú)應(yīng)用對淋巴結(jié)良惡性的診斷依然存在一定困難[8]。本次實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)移及反應(yīng)性增生淋巴結(jié)的常規(guī)超聲及CDFI 表現(xiàn)存在一定的重疊，這與以往的研究[9]相一致。CEUS作為一種無創(chuàng)、無輻射且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的技術(shù)，近年來被越來越多地應(yīng)用于淋巴系統(tǒng)的臨床及動物實(shí)驗(yàn)研究中。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)小鼠眶后靜脈叢注射超聲造影劑的方法，實(shí)時(shí)動態(tài)觀察淋巴結(jié)內(nèi)微血流灌注情況。使用的第二代超聲造影劑SonoVue，即六氟化硫微泡，微泡平均直徑為2.5 μm，小于紅細(xì)胞直徑，因而可以自由穿過淋巴結(jié)內(nèi)微血管，同時(shí)增大聲阻抗差使淋巴結(jié)顯影[10]。在超聲檢查過程中，通過常規(guī)超聲先找到腫大腘窩淋巴結(jié)的最佳成像切面，之后保持探頭不動切換進(jìn)入造影模式。由于小鼠尾靜脈與腘窩淋巴結(jié)距離過近，在超聲探頭存在的情況下尾靜脈注射造影劑無法很好地保證注射成功率，因而本研究選用了小鼠眶后靜脈叢內(nèi)注射作為鼠尾靜脈注射的替代方法，其操作簡便并且經(jīng)過練習(xí)后注射成功率較高[11]。

對本次收集的50 枚腫大腘窩淋巴結(jié)的經(jīng)靜脈CEUS 圖像進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)增強(qiáng)模式多為向心性增強(qiáng)，造影劑分布呈不均勻增強(qiáng)或無增強(qiáng)，而反應(yīng)性增生淋巴結(jié)增強(qiáng)模式多為離心性增強(qiáng)，以及淋巴結(jié)內(nèi)分布均勻的高增強(qiáng)，這與先前的動物實(shí)驗(yàn)研究[12]相一致。造成這種增強(qiáng)及分布差異的原因，是正常淋巴結(jié)由淋巴門動脈供血，形成最終可到達(dá)皮質(zhì)區(qū)內(nèi)的放射狀分布的血管網(wǎng)，造影劑從淋巴門處進(jìn)入并向周圍分散流入淋巴結(jié)內(nèi)各級小血管。反應(yīng)性增生淋巴結(jié)內(nèi)空間結(jié)構(gòu)及血管網(wǎng)均規(guī)則存在，同時(shí)炎性反應(yīng)使淋巴結(jié)內(nèi)血管擴(kuò)張，血流速度加快，因而在造影圖像上就表現(xiàn)為離心性的均勻高增強(qiáng)[13]。而轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞首先通過周邊淋巴管進(jìn)入淋巴結(jié)中，伴隨著大量腫瘤新生血管形成，進(jìn)一步侵入實(shí)質(zhì)內(nèi)的腫瘤組織不斷生長壓迫淋巴結(jié)內(nèi)正常結(jié)構(gòu)，造成正常血管受壓閉塞，血流灌注降低，靜脈回流受阻，使組織失去正常血供，最終在淋巴結(jié)內(nèi)形成低灌注的腫瘤組織區(qū)及無灌注的壞死區(qū)，因此造影圖像表現(xiàn)為向心性的不均勻增強(qiáng)或不增強(qiáng)[14]。

本研究結(jié)果顯示，在常規(guī)超聲基礎(chǔ)上聯(lián)合經(jīng)靜脈CEUS 診斷小鼠腘窩淋巴結(jié)良惡性質(zhì)的準(zhǔn)確度要高于單獨(dú)的常規(guī)超聲檢查。但實(shí)際操作中依然存在以下幾個方面因素影響著超聲對小鼠腫大淋巴結(jié)的準(zhǔn)確診斷：1）小鼠的腘窩淋巴結(jié)空間結(jié)構(gòu)以及聲像圖表現(xiàn)與人SLN 存在差異；2）小鼠淋巴結(jié)過?。[大淋巴結(jié)縱徑多在4～8 mm），影響醫(yī)師的判斷；3）沒有摸索出最合適小鼠淋巴結(jié)的超聲造影條件。

綜上所述，經(jīng)靜脈CEUS 對Balb/c 小鼠乳腺癌足墊成瘤腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的診斷具有一定的應(yīng)用價(jià)值，本研究可為后續(xù)對小鼠淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及通過超聲方法評估淋巴結(jié)狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)帶來一定的參考價(jià)值。