文 麗，劉華鋼，羅 軼，賴(lài) 玲，陸仕華，秦艷娥（.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 500；.廣西壯族自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 5009；.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 500；.南寧市第一人民醫(yī)院，廣西 南寧 50000）

三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的主要有效活性成分，治療心血管疾病效果較為顯著，臨床上有多種以PNS為主要成分的制劑用于治療心血管疾病如冠心病、高血壓病、心力衰竭等[1]。PNS腸溶微丸能夠避開(kāi)胃酸及酶對(duì)三七總皂苷的破壞，同時(shí)增加其在腸道的吸收，因PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量最高，是質(zhì)量控制中的主要指標(biāo)成分[2-9]，故實(shí)驗(yàn)選擇該3種皂苷為指標(biāo)測(cè)定和評(píng)價(jià)對(duì)象，建立PNS腸溶微丸的含量測(cè)定方法，并對(duì)PNS腸溶微丸進(jìn)行體外釋放度考察[10-18]，為該制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑PNS（梧州制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：101124）；PNS腸溶微丸（自制，批號(hào)：110601，110603，110605）；三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)：110745-201619）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201731）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201625）（中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用）；甲醇（批號(hào)：206409）、乙腈（批號(hào)：197164）（美國(guó)Fisher Scientific公司，色譜純）；高純水（自制）；Acryl-EZER丙烯酸樹(shù)脂腸溶包衣劑（上?？?lè)康包衣技術(shù)有限公司，批號(hào)：050323）；空白微丸（上海華高藥用丸芯有限公司，批號(hào)：101201）。

1.2 儀器LC-20AD型UHPLC，配備SPD-20A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；XB-C18色譜柱（美國(guó)日旭公司）；BP210S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FE28臺(tái)式酸度計(jì)（梅特勒-托利多集團(tuán)）；BGB5-10C高效包衣機(jī)（瑞安市東方制藥有限公司）；BJ-3智能崩解實(shí)驗(yàn)儀（天津市旭陽(yáng)儀器設(shè)備有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)篩（上海篩網(wǎng)廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 PNS腸溶微丸（膠囊型）的制備 取三七總皂苷90 g，羥丙基甲基纖維素4.5 g，低取代羥丙基纖維素4.5 g，混勻，用60%乙醇溶解，置恒流泵中，開(kāi)啟漿葉不斷攪拌。將空白微丸置包衣機(jī)中滾動(dòng)預(yù)熱，噴漿液上藥，至長(zhǎng)大成丸。完成上藥后再滾轉(zhuǎn)25 min，噴丙烯酸樹(shù)脂腸溶包衣劑進(jìn)行包衣，至微丸增重20%，停止噴液，繼續(xù)滾轉(zhuǎn)25 min，取出，45℃下干燥6 h，將篩選出的微丸裝入普通膠囊，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取減壓干燥至恒重的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1各20 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成貯備液。4℃冷藏保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取0.19 g（約含PNS 20 mg），精密稱(chēng)定，至100 mL容量瓶中，加水80 mL，超聲處理15 min，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 空白輔料溶液的配制 按處方組成，取除PNS以外的所有輔料，按制備工藝要求，制成不含PNS的微丸（膠囊型），按供試品溶液制備項(xiàng)下的方法，制成空白輔料溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，流脫程度為：0 min～17 min，25%A；17～18 min，25%A→45%A；18～25 min，45%A→25%A；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。按上述色譜條件測(cè)定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的分離度分別為5.95、4.73、12.09，分離效果良好。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰計(jì)算分別為10852.3、12536.3、18825.7。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白輔料溶液各20 μL，于上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果供試品色譜峰與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致。空白輔料溶液在相應(yīng)保留時(shí)間無(wú)色譜峰，表明空白輔料對(duì)主成分無(wú)干擾。（見(jiàn)圖1）

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取空白輔料6份，再分別精密量取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對(duì)照品貯備液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下處理，獲得一組標(biāo)準(zhǔn)工作液，精密吸取20 μL，注入超高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。以濃度峰面積A為橫坐標(biāo)，以峰面積C為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)r和線性范圍。結(jié)果三七皂苷R1：C=0.0002A-3.8741（r=0.9995），線性范圍3.477～111.250 μg·mL-1，人參皂苷Rg1：C=0.0002A-1.6865（r=0.9999），線性范圍4.517～114.985 μg·mL-1，人參皂苷Rb1：C=0.0002A-0.8396（r=0.9998），線性范圍4.783～152.100 μg·mL-1，線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一濃度的PNS供試品，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積值。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的RSD分別為0.53%、1.08%、1.37%。表明該方法精密度良好。

2.4.4 檢測(cè)限與定量限 檢測(cè)限和定量限由信噪比法確定，在上述色譜條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的檢測(cè)限分別為0.584、0.631、0.565 μg·mL-1，定量限分別為1.752、1.893、1.695 μg·mL-1。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取PNS腸溶微丸，按“2.2.2”項(xiàng)下處理，供試品溶液于室溫下放置，分別于0、4、8、12、24、48 h測(cè)定，考察室溫條件下3種皂苷的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：三七皂苷R1在0、4、8、12、24、48 h含量分別為18.68、18.66、18.59、18.57、18.51、18.42 μg·mL-1，RSD為0.52%；人參皂苷Rg1在0、4、8、12、24、48 h含量分別為117.48、117.27、117.09、116.56、116.08、115.34 μg·mL-1，RSD為0.67%；人參皂苷Rb1在0、4、8、12、24、48h含量分別為67.11、67.03、66.77、66.48、66.04、65.48 μg·mL-1，RSD為0.99%。表明供試品溶液在室溫放置48 h，其3種皂苷穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品9份，每份約20 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL量瓶中，精密量取“2.2.2“項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液，分別加入高、中、低（1.2、1.0、0.8）濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備3個(gè)供試品溶液，測(cè)定各組分含量，計(jì)算加樣回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1平均回收率率分別為101.61%、100.89%、100.23%、RSD分別為1.82%、2.36%、1.45%。表明此測(cè)定方法準(zhǔn)確度較好。（見(jiàn)表1）

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

續(xù)表1：

2.4.7 樣品含量測(cè)定 分別稱(chēng)取3批腸溶微丸10 g，研細(xì)，精密稱(chēng)取粉末0.17 g（約含PNS 20 mg）置于100 mL容量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取供試品溶液20 μL進(jìn)行分析，按上述的色譜條件測(cè)定，計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的含量，結(jié)果3批腸溶微丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量分別為12.62、65.39、40.06 mg·g-1，在PNS中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量分別為10.40%、53.01%、32.49%。（見(jiàn)表2）

表2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量

2.5 PNS腸溶微丸體外釋放度 釋放度測(cè)定法根據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》通則0931溶出度與釋放度測(cè)定法檢測(cè)。

2.5.1 酸中釋放度 取0.1 mol/L鹽酸溶液900 mL，注入每個(gè)溶出杯中，待溶液溫度恒定在(37.0±0.5)℃，取供試品6粒分別投入溶出杯中，啟動(dòng)儀器，2 h后在規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量，濾過(guò)，自取樣至濾過(guò)應(yīng)在30 s內(nèi)完成。按上述色譜條件測(cè)定。

2.5.2 緩沖液中釋放度 棄去上述各溶出杯中鹽酸溶液，立即加入溫度為（37±0.5）℃的磷酸鹽緩沖液（pH值=6.8）900 mL，啟動(dòng)儀器，分別于5、15、30、45、60、90 min規(guī)定取樣點(diǎn)吸取溶出液適量，濾過(guò)，自取樣至濾過(guò)應(yīng)在30 s內(nèi)完成。按上述色譜條件測(cè)定。（見(jiàn)表3、圖2）

表3 3批制劑在酸中、磷酸鹽緩沖液中的釋放度（±s，%，n=6）

表3 3批制劑在酸中、磷酸鹽緩沖液中的釋放度（±s，%，n=6）

批號(hào) 組份 酸中2 h pH值=6.8的磷酸鹽緩沖液中時(shí)間（min）515 30 45 60 90110601 三七皂苷R1 2.18±1.23 14.11±2.04 25.02±2.6987.18±1.84 98.06±5.34102.91±4.14101.80±6.17人參皂苷Rb1 1.87±0.57 15.38±2.36 36.64±1.3280.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04人參皂苷Rg1 2.30±0.88 13.01±1.4528.77±3.2780.27±3.79 98.79±5.06103.86±5.27101.71±4.04110603 三七皂苷R1 2.04±0.92 14.44±1.72 30.44±2.5687.76±3.55 98.42±3.92 99.71±4.12 98.65±5.97人參皂苷Rb1 2.09±1.73 15.07±2.32 36.37±3.0689.67±4.39100.63±4.89101.16±5.88101.07±5.48人參皂苷Rg1 2.72±0.92 11.64±2.6229.08±3.9781.25±4.42100.97±3.83102.25±3.48 98.57±5.04110605 三七皂苷R1 2.05±0.74 14.55±1.73 30.47±3.3880.09±4.38 94.92±5.13100.06±5.56 97.32±5.17人參皂苷Rb1 1.97±1.09 16.71±2.97 33.92±3.5386.70±3.49 99.06±4.89101.56±5.72100.36±5.54人參皂苷Rg1 2.19±1.54 15.69±1.5228.99±3.7180.66±4.67100.83±3.09103.87±3.88 99.89±6.29

圖2 3批制劑在緩沖液中的釋放度（pH值=6.8）

結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在酸中釋放量小于標(biāo)示量的10%，在pH值=6.8的緩沖液中45 min累積釋放量大于標(biāo)示量的70%，符合制劑要求。

3 討論

據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，三七總皂苷口服給藥在酸性條件下會(huì)降解為苷元，而小腸是其最佳吸收部位，為提高三七總皂苷的口服生物利用度，筆者將其制備成腸溶微丸[19-20]。試驗(yàn)中考察了加熱回流和超聲提取兩種方法，兩種方法提取效率相當(dāng)，考慮超聲提取更快捷方便，故采用超聲法提取該制劑中的皂苷類(lèi)成分。參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]及2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》，采用HPLC法用乙腈-水梯度洗脫，能同時(shí)檢測(cè)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb13個(gè)指標(biāo)成分,且分離度良好，輔料無(wú)干擾，檢測(cè)時(shí)間短，可以準(zhǔn)確、快速地實(shí)現(xiàn)PNS腸溶微丸的定量測(cè)定。在體外釋放度考察中，三七總皂苷腸溶微丸中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1即使在酸液中有溶出釋放，也易被破壞降解而難以檢測(cè)出來(lái)，因此選擇磷酸鹽緩沖液（pH值=6.8）作為釋放介質(zhì)測(cè)定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的體外釋放量。筆者以三七總皂苷的胃腸道吸收特性研究為基礎(chǔ)，進(jìn)行了腸溶制劑的研究，并建立PNS腸溶微丸的指標(biāo)成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的HPLC含量測(cè)定方法，并對(duì)3批PNS腸溶微丸進(jìn)行體外釋放度考察。根據(jù)前期研究[7-9]，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1在PNS原料中的含量分別為9.16%、57.90%與32.57%，制成PNS腸溶微丸后在PNS中的含量為分別為10.40%、53.01%與32.49%，差異不明顯，說(shuō)明PNS主要有效成分的含量在制備過(guò)程中無(wú)明顯變化。釋放度測(cè)定結(jié)果表明，3批制劑的體外釋放度良好，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1的釋放行為無(wú)明顯差異，符合《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)腸溶制劑的要求，上述研究結(jié)果減少了制劑開(kāi)發(fā)的盲目性，為今后三七總皂苷口服給藥途徑的研究提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。