張美東 凌 晨 沙 航 陳 夢 王 丹 羅相忠 鄒桂偉 梁宏偉

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223; 2. 華中農業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430000)

水體溶解氧是魚類正常生活所必需的重要因子之一, 直接影響著魚類的生長、發(fā)育和繁殖[1], 其主要受到天氣變化、水體富營養(yǎng)化和水體污染等因素的影響。近年來, 由于水環(huán)境的污染, 水中低氧的嚴重程度、發(fā)生頻率和持續(xù)時間不斷增加, 對魚類的生存造成巨大的影響[2], 使其無法維持正常的能量代謝平衡、免疫力下降和代謝紊亂等, 甚至導致其個體死亡[3]。

在通常情況下, 細胞中活性氧自由基(Reactive oxidative species, ROS)的形成和清除是平衡的, 細胞需要生成少量的ROS用于調節(jié)細胞活動和基因表達。但當魚類遭受低氧脅迫時, 體內會產(chǎn)生氧化應激反應, 生成大量的ROS[4,5], 而大量活性氧自由基會打破抗氧化防御系統(tǒng)的平衡[6], 引起細胞和組織的生理和病理反應, 使細胞的功能喪失、凋亡或壞死[7]。因而, 為了減少大量活性氧自由基造成的破壞, 魚類機體內啟動超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(Catalases, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSHPX)等組成的抗氧化酶防御系統(tǒng), 從而清除超氧化陰離子自由基和過氧化氫來維持體內動態(tài)平衡[8]。超氧化物歧化酶作為清除活性氧自由基的抗氧化酶[9], 是生物體抗氧化防御的第一道屏障。過氧化氫酶是一種結合酶, 與SOD共同組成一套活性氧清除酶系統(tǒng)[10]。谷胱甘肽過氧化物酶則是生物體內抗氧化防御體系中一種重要的抗氧化劑[11]。在西伯利亞鱘(Acipenser baerii)[12]、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[13]、青田鯉(Cyprinus carpio varqingtianensis)[14]及黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[15]等魚類的低氧脅迫中均發(fā)現(xiàn)抗氧化酶能起到積極的響應。

鰱在我國分布廣泛, 是我國重要的淡水養(yǎng)殖“四大家魚”之一[16]。由于鰱生性活潑, 在遭到應激刺激時易躍出水面, 且耐低氧能力差, 在養(yǎng)殖過程中易出現(xiàn)因缺氧而引發(fā)的浮頭、泛塘甚至大規(guī)模死亡等現(xiàn)象, 給養(yǎng)殖戶帶來巨大經(jīng)濟損失。目前,關于魚類低氧脅迫及復氧的研究, 大多數(shù)集中在抗氧化酶活性的變化[12—15]或相關基因的克隆和表達[17]。本研究旨在探究低氧脅迫及復氧后鰱血清、心臟和肝臟中抗氧化酶活性的變化, 及SODs mRNA動態(tài)表達特征, 以期為鰱在低氧脅迫下氧化應激的響應機制的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗鰱來自中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所窯灣試驗場。實驗前選取體重(100±10) g的鰱暫養(yǎng)在10 m3的養(yǎng)殖桶中, 7d后用于正式實驗。

1.2 實驗方法

急性低氧、持續(xù)低氧及復氧實驗隨機從實驗魚中選取健康且活潑的個體用于實驗。在水溫(27.0±0.5)℃下, 向水中充入空氣和氮氣來維持水中溶解氧的濃度, 同時用水質分析儀(HQ30D, Hach)測定水中溶解氧的濃度。急性低氧實驗時向水中充入氮氣和空氣, 使水中溶氧分別降至2.5 mg/L(Acute Hypoxia-2.5, AH-2.5)、1.5 mg/L(AH-1.5)、0.5 mg/L(AH-0.5)和0.25 mg/L(AH-0.25)時, 將魚放入水中低氧脅迫0.5h。持續(xù)低氧實驗是在水體中充入氮氣和空氣使其水中溶氧維持在2.5 mg/L時, 將魚放入水中分別持續(xù)低氧脅迫3h(Continuous Hypoxia-3, CH-3)、6h(CH-6)、12h(CH-12)和24h(CH-24)。復氧實驗則是在溶解氧為2.5 mg/L下持續(xù)低氧24h后, 將正常游動的魚轉至(6.5±0.3) mg/L的常氧中, 分別復氧處理3h(Reoxygenation-3, R-3)、6h(R-6)、12h(R-12)和24h(R-24)。在低氧脅迫前,隨機取5條作為常氧對照組(CK)。

樣品采集與處理樣品采集前用150 mg/L的MS-222麻醉實驗魚以降低應激反應。在急性低氧、持續(xù)低氧、復氧和常氧對照組中, 隨機取5尾用一次性滅菌注射器在尾椎靜脈采血, 血液放入冰箱4℃靜置2h后, 3500 r/min離心10min, 吸取上清液制備血清, 所得血清為無色或是淡黃色, 將血清放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血后迅速解剖魚體, 取出肝臟和心臟組織置于干凈無菌的凍存管中, 液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活力測定按照試劑盒(南京建成生物工程有限公司)使用說明進行血清、肝臟和心臟組織中抗氧化指標, 主要包括總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)的測定。

總RNA提取及cDNA合成鰱心臟及肝臟組織根據(jù)Trizol試劑說明書提取總RNA, 用超微量分光光度計(NP80, IMPLEN)檢測提取的RNA濃度并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用HiScript?Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)合成cDNA, -20℃保存。

熒光定量PCR對鰱心臟及肝臟進行Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的動態(tài)表達特征分析引物采用本實驗室已發(fā)表引物[17]。其中Cu/Zn-SOD基因上游引物為5′-CCAACCGATAGTGAAAGACACGT-3′, 下游引物為5′-CTCATTGCCTCCCTTCCCCAAGT-3′;Mn-SOD基因上游引物為5′-TGTGACGACCCA AGTCTCCCTT-3′, 下游引物為5′-CTGTGGCTCTCC TCCACCATTC-3′; 內參基因β-actin上游引物為5′-GAACCCCAAAGCCAACAG-3′, 下游引物為5′-CAGAGTCCATCACGATACCAG-3′。利用ABI 7500熒光定量PCR儀進行檢測, 每個樣品重復3次。PCR反應體系為20 μL: 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL, 上下游引物各0.4 μL,Template cDNA 1 μL, ddH2O 8.2 μL。擴增程序為:95℃預變性30s; 95℃變性10s, 60℃退火30s, 共40個循環(huán), 95℃15s, 60℃退火60s, 95℃15s。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics V24.0對數(shù)據(jù)進行單因子方差分析及Duncan’s多重比較,P＜0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 鰱血清中抗氧化酶活性

在急性低氧脅迫后, 鰱血清中T-AOC和GSHPX酶活性在溶解氧濃度0.25 mg/L時升高, 較常氧水平分別升高了35%和6%, 而SOD的活性在氧濃度0.25 mg/L時較常氧水平降低了9%(P＞0.05), CAT的活性隨著溶解氧的降低持續(xù)升高, 在氧濃度2.5 mg/L時顯著升高(P＜0.05), 高于常氧水平20%(圖 1)。在持續(xù)低氧脅迫后, 鰱血清中T-AOC、CAT和GSHPX的活性在持續(xù)低氧脅迫12h時達到最高(P＜0.05),較常氧水平分別升高了62%、58%和25%, 而SOD的活性在低氧脅迫3h時達到最高(P＞0.05)。在低氧脅迫24h時, T-AOC、CAT和GSH-PX的活性仍高于常氧水平, 但SOD的活性低于常氧水平15%(P＞0.05)。在復氧后, 鰱血清中CAT和GSH-PX的活性在復氧3h時顯著高于常氧水平(P＜0.05), 復氧24h時,SOD、CAT和GSH-PX的活性與常氧水平無顯著差異(P＞0.05)。而T-AOC酶活性隨復氧時間的增加持續(xù)下降(P＜0.05), 在復氧6h時恢復至常氧水平(P＞0.05; 圖 2)。

圖1 急性低氧脅迫對鰱血清中抗氧化酶活性的影響Fig. 1 Effects of acute hypoxic stress on antioxidant enzyme activity in serum of H. molitrix

圖2 持續(xù)低氧脅迫及復氧對鰱血清中抗氧化酶活性的影響Fig. 2 Effects of continuous hypoxic stress and reoxygenation on antioxidant enzyme activity in serum of H. molitrix

2.2 鰱心臟組織中抗氧化酶活性

隨著溶解氧的降低, 鰱心臟中T-AOC和CAT活性呈下降趨勢, T-AOC在氧濃度2.5 mg/L時顯著低于常氧水平21%(P＜0.05), 而CAT在溶解氧濃度1.5 mg/L時顯著低于常氧水平37%(P＜0.05)。SOD和GSHPX酶活性在氧濃度0.25 mg/L時分別高于常氧水平13%和26%(圖 3)。在持續(xù)低氧脅迫后, 鰱心臟中TAOC和CAT的活性隨著低氧時間增加呈下降趨勢,在持續(xù)低氧3h時顯著低于常氧水平35%和16%(P＜0.05)。SOD的活性隨著低氧脅迫時間增加呈上升趨勢, 在低氧3h時顯著高于常氧水平22%(P＜0.05)。GSH-PX的活性在低氧脅迫3h時達到最高(P＜0.05),隨后開始下降, 但是在持續(xù)低氧24h時仍高于常氧水平22%。在復氧后, 鰱心臟中T-AOC、SOD和GSH-PX的活性在復氧3h時迅速恢復至常氧水平(P＞0.05), 而SOD和GSH-PX的活性在復氧6h時又顯著升高(P＜0.05), 之后隨復氧時間的增加逐漸恢復至常氧水平(P＞0.05)。CAT酶活性隨復氧時間的增加呈上升趨勢, 在復氧12h時恢復常氧水平(P＞0.05;圖 4)。

圖3 急性低氧脅迫對鰱心臟組織中抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effects of acute hypoxic stress on antioxidant enzyme activity in the heart tissue of H. molitrix

圖4 持續(xù)低氧脅迫及復氧對鰱心臟組織中抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of continuous hypoxic stress and reoxygenation on antioxidant enzyme activity in the heart tissue of H. molitrix

2.3 鰱肝臟組織中抗氧化酶活性

隨著溶解氧的降低, 鰱肝臟中T-AOC和GSHPX酶活性持續(xù)下降, 在溶解氧濃度0.25 mg/L時較常氧水平分別下降27%和21%(P＜0.05)。SOD和CAT酶活性在氧濃度2.5 mg/L時顯著升高, 且SOD酶活性達到最高, 較常氧水平升高41%(P＜0.05)。之后隨著氧濃度的下降, SOD酶活性明顯下降, 但在氧濃度0.25 mg/L時仍顯著高于常氧水平(P＜0.05;圖 5)。在持續(xù)低氧脅迫后, 鰱肝臟中T-AOC、SOD和GSH-PX酶活性在低氧脅迫6h時均降到最低(P＜0.05), 隨后開始升高, 但T-AOC和GSH-PX酶活性在低氧脅迫24h時仍低于常氧水平(P＞0.05), 而SOD酶活性在低氧脅迫24h時顯著高于常氧水平32%(P＜0.05)。CAT酶活性隨著低氧脅迫時間增加呈上升趨勢, 在低氧脅迫3h時相比常氧水平顯著升高(P＜0.05)。在復氧后, 鰱肝臟中T-AOC活性在復氧3h時顯著降低(P＜0.05), 在復氧6h時恢復常氧水平(P＞0.05), 而SOD酶活性在復氧3h恢復至常氧水平。CAT酶活性隨復氧時間的增加顯著下降(P＜0.05), 在復氧12h時恢復常氧水平(P＞0.05; 圖 6)。

圖5 急性低氧脅迫對鰱肝臟組織中抗氧化酶活性的影響Fig. 5 Effects of acute hypoxic stress on antioxidant enzyme activity in liver tissue of H. molitrix

圖6 持續(xù)低氧脅迫及復氧對鰱肝臟組織中抗氧化酶活性的影響Fig. 6 Effects of continuous hypoxic stress and reoxygenation on antioxidant enzyme activity in the liver tissue of H. molitrix

2.4 鰱心臟和肝臟組織中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達特征

Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因在鰱低氧脅迫及復氧下的心臟和肝臟中的表達分析顯示, 在心臟組織中, 隨著溶解氧濃度的降低,Cu/Zn-SOD基因在氧濃度2.5 mg/L時達到最高(P＜0.05),Mn-SOD基因在氧濃度0.5 mg/L時達到最高, 分別是常氧水平的1.8倍和4.7倍(P＜0.05), 而在氧濃度0.25 mg/L時Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因的表達水平則與常氧相比無顯著差異(P＞0.05)。在持續(xù)低氧脅迫后,Cu/Zn-SOD在低氧3h時顯著下降(P＜0.05),Mn-SOD基因則顯著升高; 而在低氧6h時Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因的表達水平最高(P＜0.05), 之后隨低氧脅迫時間的增加而下降, 24h時顯著低于常氧水平(P＜0.05)。在復氧后,Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表達呈上升趨勢, 在復氧24h時恢復至常氧水平(P＞0.05; 圖 7)。在肝臟組織中, 隨著溶解氧濃度的降低,Cu/Zn-SOD在氧濃度1.5 mg/L表達水平達到最高(P＜0.05), 是常氧水平的14.7倍;Mn-SOD基因表達呈持續(xù)上升的趨勢, 在氧濃度2.5 mg/L時就已顯著上調2.2倍(P＜0.05)。隨著低氧時間的增加,Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達呈上升趨勢, 在持續(xù)低氧3h時已顯著高于常氧水平(P＜0.05)。在復氧后,Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因在復氧3h時的表達顯著降低(P＜0.05), 到復氧24h時恢復至常氧水平(P＞0.05; 圖 8)。

圖7 急性低氧脅迫、持續(xù)低氧脅迫及復氧對鰱心臟組織中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量的影響Fig. 7 Effects of acute hypoxic stress, continuous hypoxic stress and reoxygenation on Cu/Zn-SOD and Mn-SOD gene expression in the heart tissue of H. molitrix

圖8 急性低氧脅迫、持續(xù)低氧脅迫及復氧對鰱肝臟組織中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量的影響Fig. 8 Effects of acute hypoxic stress, continuous hypoxic stress and reoxygenation on Cu/Zn-SOD and Mn-SOD gene expression in the liver tissue of H. molitrix

3 討論

3.1 低氧脅迫對鰱抗氧化酶活力的影響

當機體受到低氧脅迫時, 會產(chǎn)生氧化應激反應,即產(chǎn)生大量活性氧自由基, 造成機體細胞和組織的氧化損傷[6]。此時, 機體通過抗氧化酶和抗氧化劑來調控體內ROS來降低氧化應激造成的損傷。清除體內ROS的抗氧化酶和抗氧化劑主要包括SOD、CAT、GSH-PX。SOD作為機體抗氧化防御系統(tǒng)的第一道屏障, 通過歧化反應將對機體有害的超氧自由基(O2-)轉化為H2O2和O2, 從而降低機體內超氧自由基的含量[18]。CAT則可以催化H2O2轉化為O2和H2O。同時, GSH-PX可以通過催化還原型G-SH將細胞內產(chǎn)生的ROS和H2O2還原[19]。

在低氧脅迫開始階段, 低氧造成鰱體內ROS含量上升, 激活了體內抗氧化酶系統(tǒng)。此時鰱血清、心臟和肝臟中超氧化物歧化酶活性迅速升高,SOD作為消除ROS的第一道防線, 在機體面臨氧化應激時率先被激活, 將對機體有害的超氧自由基(O2-)轉化為H2O2和O2[20]。同時, 鰱血清和肝臟中CAT活力顯著升高, 且血清和心臟中GSH-PX活力顯著升高, CAT與GSH-PX同時發(fā)揮作用, 減少氧化應激對鰱機體造成的損害。在卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[21]、刺參(Apostichopus japonicus)[22]和南美白對蝦(Litopenaeus Vannamei)[23]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)。鰱在低氧脅迫下體內進行無氧呼吸, 產(chǎn)生大量ROS急劇消耗抗氧化酶, 導致SOD活性下降。之后隨著低氧脅迫的進一步加劇, 鰱體內SOD活力快速升高, 以消除ROS, 避免對機體造成嚴重損傷,這與在中華烏塘鱧[24](Bostrychus sinensis)中的研究結果一致。而此時鰱體內SOD酶產(chǎn)生的H2O2, 超過了CAT和GSH-PX的承受范圍, 導致鰱心臟中CAT和GSH-PX酶活力受到抑制。這與日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[25]、大黃魚(Larimichthys crocea)[26]及鯉(Cyprinus carpio)[27]的研究結果一致。在復氧3h后, 鰱肝臟中SOD酶活力迅速恢復至常氧水平, 可能是肝臟作為硬骨魚類機體新陳代謝的主要場所, 在物質代謝、解毒、凝血和防御等生命活動過程中起著至關重要的作用[28,29]。而在復氧3h血清中CAT和GSH-PX酶活力顯著高于常氧水平, 此時機體仍屬于氧化應激狀態(tài), CAT和GSHPX酶發(fā)揮作用來消除機體內過量的H2O2, 與葛氏鱸塘鱧(Perccottus glenii)中[30]的研究相符, 隨著復氧時間的增加, 鰱血清、心臟和肝臟中CAT和GSH-PX酶活力在24h內均恢復常氧水平, 表明機體內抗氧化酶清除了氧化應激產(chǎn)生的有害物質, 使機體逐漸恢復正常。

總抗氧化能力是用于衡量機體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合性指標, T-AOC的大小反映機體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態(tài)[31]。張倩等[32]發(fā)現(xiàn)低氧脅迫下鯽(Carassius auratus)血清、肌肉和鰓中總抗氧化能力持續(xù)上調, 復氧后恢復至正常水平。而在本研究中, 低氧脅迫后鰱血清中T-AOC顯著上升, 心臟和肝臟組織中T-AOC的活性顯著下降, 與團頭魴[33](Megalobrama amblycephala)在低氧脅迫中, 隨著溶解氧濃度的降低, T-AOC的活性在血清中逐漸增加, 在肝臟中逐漸降低的結果一致, 表明低氧脅迫大量消耗心臟和肝臟組織中的抗氧化物質, 使心臟和肝臟組織中的T-AOC活性明顯下降。在復氧后, 鰱血清和心臟中T-AOC逐漸恢復至正常水平, 鰱可以迅速對血清和心臟內氧自由基進行清除, 以應對低氧脅迫對機體造成的損傷。而肝臟中T-AOC先顯著下降后恢復至正常水平, 與管越強等[34]在持續(xù)低氧脅迫及復氧后的日本沼蝦肝胰腺和肌肉組織中T-AOC先顯著下降后恢復至正常水平的結果相似。

3.2 低氧脅迫對鰱Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量的影響

超氧化物歧化酶(SOD)作為機體內重要的抗氧化酶, 其表達變化常用于反映機體氧化應激水平[35]。目前魚類中僅發(fā)現(xiàn)兩種超氧化物歧化酶, 即Cu/Zn-SOD和Mn-SOD[36]。其中,Cu/Zn-SOD包括胞質Cu/Zn-SOD和細胞外Cu/Zn-SOD, 而Mn-SOD則是一種線粒體內SOD酶[37]。當發(fā)生氧化應激時, 機體可以通過激活SODs基因合成超氧化物歧化酶[38]。細胞內SODs基因表達水平的提高, 可以減少ROS對機體的損傷[39]。

在低氧脅迫早期SODs系統(tǒng)會被激活, 通過增加Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量來消除機體內因氧化應激產(chǎn)生的過量的ROS, 因此鰱心臟和肝臟中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量在低氧脅迫前期顯著上升。而在低氧脅迫后期, 鰱心臟中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達顯著下降, 這與瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)[40]的研究結果相似。SODs基因被抑制可能是由于低氧脅迫后期鰱心臟中有氧呼吸減弱, 影響細胞內ATP的生成、RNA的轉錄、蛋白質的翻譯等[41]。然而心臟中SOD酶活性并沒有因Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量顯著下降而下降, 反而顯著上升。可能是魚類在低氧脅迫后, 為保護心臟和腦等對機體生存起重要作用的組織, 血液會重新分配抗氧化酶以確保其組織可以在低氧脅迫下維持正常的生理機能。因而鰱肝臟中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量在低氧脅迫后均顯著上升, 而肝臟和血液中SOD酶活力卻顯著下降。在復氧3h后, 鰱心臟及肝臟中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量顯著低于正常水平。復氧作為一種氧化應激, 也會導致Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達被抑制。隨著復氧時間的增加,Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達也恢復至常氧水平, 與瓦氏黃顙魚[42]研究結果相一致, 在復氧條件下, 瓦氏黃顙魚的肝臟和腦中Cu/Zn-SOD及Mn-SOD基因表達量可以迅速恢復至常氧水平。

4 結論

低氧脅迫會使鰱產(chǎn)生氧化應激反應, 而應激后對其進行復氧也會使鰱產(chǎn)生應激反應, 激活體內的抗氧化酶防御系統(tǒng)。在低氧脅迫開始時, 鰱血清、心臟和肝臟中抗氧化酶會發(fā)生顯著性變化來應對機體內的氧化應激。而隨著低氧脅迫的進一步加劇, 氧化應激會對機體造成損傷, 使得機體內抗氧化酶活力下降。在復氧后, 機體也會產(chǎn)生氧化應激,導致機體內抗氧化酶活力顯著上升, 而隨著復氧時間的增加, 機體內抗氧化酶活力會逐漸恢復至正常水平。本研究為更好地解析鰱在低氧脅迫下抗氧化應激機制提供了基礎數(shù)據(jù)。