周 輝，沈偉鋒，邵平揚

（嘉興市第一醫(yī)院檢驗科，浙江 嘉興 314001）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為19～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，能夠通過與靶基因的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）特異結(jié)合，促進(jìn)目標(biāo)mRNA 降解或抑制其翻譯。miRNA 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中約30%的mRNA 的表達(dá)，在細(xì)胞分化、增值和凋亡等各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，許多miRNA 與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮了促癌或者抑癌的作用。外泌體是由細(xì)胞內(nèi)吞泡膜向內(nèi)凹陷形成的多泡小體與細(xì)胞膜融合后釋放到細(xì)胞外的小囊泡，直徑為30～150 nm，廣泛存在于各種體液中[3，4]。在腫瘤微環(huán)境中，通過外泌體傳遞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 和miRNA 等物質(zhì)是除了分泌細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子等可溶性介質(zhì)外細(xì)胞間通訊的重要方式[5，6]。胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告[7]，胃癌是全球發(fā)病率第5 高、致死率第3 高的癌癥，2018 年全球新發(fā)胃癌病例超過100 萬例，同時因胃癌致死病例超過78.3 萬例。中國是胃癌高發(fā)國家，其發(fā)病率和致死率均僅次于肺癌[8]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最常見的轉(zhuǎn)移形式，其發(fā)生率隨腫瘤浸潤深度的增加而提高[9]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性胃癌患者5 年無復(fù)發(fā)生存率僅為53%[10，11]。缺氧是包括胃癌在內(nèi)所有實體瘤一種普遍和持續(xù)存在的共同特征，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[12]。缺氧不但能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，還會促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）和對化療藥物耐受[13-15]。本研究通過分析缺氧誘導(dǎo)的SGC-7901 胃癌細(xì)胞系來源的外泌體傳遞miRNA 對常氧胃癌細(xì)胞的作用，揭示外泌體在缺氧微環(huán)境中對胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone）；胎 牛 血 清（fetal bovineserum，F(xiàn)BS）（Hyclone）；無外泌體培養(yǎng)基Exo-clearTM Complete Growth Medium（SBI）；外泌體提取試劑ExoQuick-TCTM Exosome Precipitation Solution（SBI）；Celltracker CM-DiI 活細(xì)胞示蹤劑（上海翊圣）；miR-199a-5p 類似物（miR-199a-5p mimics） 和miR-199a-5p 類似物陰性對照（miR-199a-5p mimicsNC）（委托上海吉瑪生物公司合成）；lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）；JEM-1230 透射電子顯微鏡（JEOL）；3311 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；CKX41 光學(xué)倒置顯微鏡（Olympus）、NanoDrop超微量分光光度儀（Thermo Fisher）、StepOne Plus 熒光定量PCR 儀（ABI）；G:BOX 系列智能熒光、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene）、垂直電泳儀（BIO-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧誘導(dǎo) SGC-7901 細(xì)胞置于含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞使用無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后用于后續(xù)實驗。使用含200 μmol/L CoCl2的無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞模擬細(xì)胞缺氧，以不含CoCl2的無外泌體培養(yǎng)基為對照。

1.2.2 外泌體的提取 SGC-7901 細(xì)胞分別在常氧（Normoxia）和缺氧（Hypoxia）條件下培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液3000 g 離心15 min 去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。轉(zhuǎn)移上清液至無菌離心管，加入上清液1/5 體積的外泌體提取液，混勻后4 ℃靜置過夜。1500 g 離心30 min，棄上清；1500 g 離心5 min去除殘余液體。使用PBS 緩沖液重懸外泌體，BCA法測定蛋白濃度，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 透射電子顯微術(shù)分析 取10 μl 外泌體樣品于蠟盤上。取銅網(wǎng)使有支持膜的表面與樣品液表面接觸，靜置5 min 取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，稍晾干。取3%磷鎢酸溶液，滴于臘盤上。吸附有樣品的銅網(wǎng)放置于染液表面（樣品與染液接觸），靜置5 min。取出銅網(wǎng)，用濾紙條吸除多余的液滴，白熾燈下晾干。使用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)并拍照。

1.2.4 Western 免疫印記 使用RIPA 裂解液提取外泌體總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 提取的總蛋白，經(jīng)15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）至溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣后轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1∶1000 稀釋的兔抗人CD9、CD63 單克隆抗體，4℃搖床上孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶10000）室溫孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像分析儀中化學(xué)光敏模式曝光顯影。

1.2.5 劃痕實驗 通過體外劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力[16]。細(xì)胞消化后接種至6 孔板，培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞鋪滿板底后，用200 μl 槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 沖洗孔板3 次以洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后取出拍照，根據(jù)收集圖片數(shù)據(jù)分析實驗結(jié)果。劃痕閉合率（%）=細(xì)胞遷移后的表面積/總表面積×100。

1.2.6 侵襲實驗 使用Matrigel 包被Transwell 小室，細(xì)胞消化后使用含0.5% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞并接種于上室，下室加入400 μl 含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基。16 h 后刮去上室細(xì)胞，使用甲醛水溶液固定30 min 后結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照，使用ImageJ 軟件統(tǒng)計遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 miRNA 測序和生物信息學(xué)分析 正常和缺氧外泌體miRNA 文庫構(gòu)建、序列測定和生物信息學(xué)分析由廣州吉賽生物完成。使用STAR 對讀取的數(shù)據(jù)繪制基因組，miRdeep 用于計算miRNA 的表達(dá)[17]。采用TMM（trimmed mean of M-values）方法對測序片段計數(shù)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。用edgeR 程序鑒定差異表達(dá)基因，表達(dá)差異超過1.5 倍且P＜0.05 的miRNA 認(rèn)為是差異表達(dá)。

1.2.8 實時熒光定量PCR 根據(jù)miRNA miRNeasy Micro Kit 操作說明分別提取缺氧和常氧細(xì)胞外泌體RNA，并使用實時熒光逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（realtime quantitative reverse transcription -polymerase chain reaction，real-time qRT-PCR）測定miR-199a-5p 的表達(dá)量，使用GAPDH 作為內(nèi)參。

1.2.9 miR-199a-5p 類似物轉(zhuǎn)染 使用lipofectamine 2000 把miR-199a-5pmimics 或miR-199a-5p mimicsNC 導(dǎo)入SGC-7901 細(xì)胞中以提高細(xì)胞內(nèi)miR-199a-5p 水平，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)觀察 透射電子顯微鏡下顯示，常氧和缺氧SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體均呈圓形或橢圓形的杯狀結(jié)構(gòu)，直徑為50～150 nm，多個視野對比外泌體形態(tài)未見明顯差異，見圖1。

2.2 外泌體標(biāo)志物檢測 常氧和缺氧SGC-7901 細(xì)胞分泌外泌體進(jìn)行Western 印記分析，結(jié)果顯示兩組外泌體均表達(dá)CD63 和Tsg101 蛋白標(biāo)志物，見圖2。

2.3 缺氧腫瘤細(xì)胞來源的外泌體對常氧腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的影響 劃痕實驗顯示，缺氧處理SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901細(xì)胞劃痕閉合率高于常氧SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞（P＜0.05），見圖3A。侵襲實驗顯示，缺氧處理SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞移動到transwell 小室下方的數(shù)量高于常氧SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），見圖3B。

圖1 常氧和缺氧條件下SGC-7901 細(xì)胞源性外泌體的電鏡特點（×50000）

圖2 常氧和缺氧SGC-7901 細(xì)胞分泌外泌體CD63和Tsg101 蛋白標(biāo)志物表達(dá)情況

圖3 缺氧腫瘤細(xì)胞來源外泌體對常氧腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4 缺氧外泌體miRNA 的表達(dá)情況 測序和RTPCR 研究顯示，缺氧外泌體中miR-199a-5p 的表達(dá)高于常氧外泌體（P＜0.05），見圖4。

2.5 缺氧外泌體傳遞miR-199a-5p 對常氧胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響 為了分析缺氧SGC-7901 細(xì)胞源性外泌體是否通過傳遞miR-199a-5p 促進(jìn)常氧SGC-7901 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，將miR-199a-5p mimics 和miR-a99a-5p NC 分別導(dǎo)入缺氧培養(yǎng)的SGC-7901 細(xì)胞，提取外泌體與常氧SGC-7901 細(xì)胞共培養(yǎng)。劃痕實驗顯示，導(dǎo)入miR-199a-5p mimics 細(xì)胞來源的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞劃痕閉合率高于導(dǎo)入miR-199a-5p mimicsNC 細(xì)胞來源的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞（P＜0.05），見圖5A。侵襲實驗顯示，導(dǎo)入miR-199a-5p mimics 細(xì)胞來源的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞移動到transwell 小室下方的數(shù)量高于導(dǎo)入miR-199a-5p mimicsNC 細(xì)胞來源的外泌體共培養(yǎng)的常氧SGC-7901 細(xì)胞（P＜0.05），見圖5B。

圖4 缺氧外泌體miRNA 的表達(dá)情況

圖5 缺氧腫瘤細(xì)胞來源外泌體傳遞miR-199a-5p 對常氧腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲的影響

3 討論

外泌體由細(xì)胞分泌釋放，在血液等循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)傳播，最后可被其他細(xì)胞吞噬，是細(xì)胞間通訊的重要介質(zhì)[18]。外泌體可以介導(dǎo)長距離細(xì)胞間通訊而無需細(xì)胞間接觸，加上納米大小的尺寸和生物相容性的特性使其成為潛在的藥物載體受到臨床廣泛關(guān)注[19]。缺氧是由于腫瘤細(xì)胞快速增殖造成大量氧氣被消耗，且腫瘤內(nèi)部往往因血管生成異常等原因?qū)е卵鯕夤?yīng)不足，使得腫瘤細(xì)胞處于缺氧的微環(huán)境中[20，21]。多項研究發(fā)現(xiàn)[22-24]，缺氧可通過多種方式影響腫瘤的生物學(xué)行為，如加速腫瘤的擴(kuò)散和惡性進(jìn)展，調(diào)控癌細(xì)胞的分化，選擇性抵抗凋亡和促進(jìn)化療耐藥等，特別是在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，從EMT 到器官親和性轉(zhuǎn)移，缺氧都起到了重要的調(diào)節(jié)作用[25]。在胃癌中，缺氧也發(fā)揮了重要的促癌作用，其不但能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，還會促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT 和對化療藥物耐受[13-15]。

本研究使用外泌體提取試劑分別提取了常氧和缺氧SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體，透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)條件的細(xì)胞分泌的外泌體均呈直徑為50～150 nm 圓形或橢圓形的杯狀結(jié)構(gòu)，表明缺氧環(huán)境沒有改變SGC-7901 細(xì)胞分泌的外泌體的大小和形態(tài)。Western 印記驗證了常氧和缺氧外泌體均表達(dá)已知的外泌體蛋白標(biāo)志物CD63 和Tsg101。為了分析缺氧胃癌細(xì)胞分泌的外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用，本研究使用含CoCl2的無外泌體培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901 細(xì)胞模擬細(xì)胞缺氧，提取外泌體后與常氧SGC-7901 細(xì)胞共培養(yǎng)，劃痕和侵襲實驗顯示，缺氧SGC-7901 細(xì)胞來源外泌體能夠促進(jìn)常氧SGC-7901 細(xì)胞遷移和侵襲。

近些年，外泌體介導(dǎo)miRNA 在細(xì)胞間通訊中的作用尤其受到關(guān)注，因miRNA 可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)一系列病理生理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[26]，來自腫瘤細(xì)胞的外泌體中的miRNA 能夠通過重塑腫瘤微環(huán)境來支持腫瘤的生長。Hsieh CH 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞外泌體來源的miR-21 增加了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2 樣極化。另有研究發(fā)現(xiàn)[28]，缺氧微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體miRNA 變化密切相關(guān)。Wang X 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧腫瘤源性miR-301a 通過調(diào)控PTEN/PI3Kγ 介導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移，且缺氧使肺癌細(xì)胞分泌外泌體中miR-103a 水平升高，從而增強(qiáng)腫瘤血管生成和血管通透性，最終導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，外泌體miRNA 改變與胃癌進(jìn)展過程中缺氧之間關(guān)系的作用和機(jī)制尚未被詳細(xì)揭示。本研究利用測序和RTPCR 發(fā)現(xiàn)，缺氧外泌體中miR-199a-5p 的表達(dá)高于常氧外泌體，為了進(jìn)一步分析缺氧SGC-7901 細(xì)胞源性外泌體是否通過傳遞miR-199a-5p 促進(jìn)常氧SGC-7901 細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，本研究將miR-199a-5p mimics 導(dǎo)入缺氧培養(yǎng)的SGC-7901 細(xì)胞，劃痕和侵襲實驗顯示，缺氧SGC-7901 細(xì)胞來源外泌體能夠傳遞miR-199a-5p 促進(jìn)常氧SGC-7901 細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，缺氧微環(huán)境可能會刺激胃癌細(xì)胞產(chǎn)生富含miR-199a-5p 的外泌體，并將其輸送至周圍常氧胃癌細(xì)胞以促進(jìn)其遷移和侵襲。