疼痛是臨床最常見的癥狀，已被列為第五大生命指征

。疼痛通常由特定疾病或損傷引起，幾乎所有成年人都經(jīng)歷過疼痛

，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將慢性疼痛列為一種疾病。新近流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，約1/3 的人經(jīng)歷過慢性疼痛，老年人發(fā)病率呈年齡遞增趨勢(shì)

。在我國(guó)，疼痛門診中30%～40%的病人因患有慢性疼痛而就診。炎性痛是目前臨床上最為常見的病理性疼痛之一，嚴(yán)重干擾著人類的生活和工作，在美國(guó)每年有1.16 億人罹患過炎性疼痛

。炎性痛伴隨痛覺過敏（對(duì)傷害性刺激的反應(yīng)增強(qiáng)）或痛覺異常（由正常無害刺激觸發(fā)疼痛）現(xiàn)象，主要通過服用非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥和糖皮質(zhì)激素等藥物治療，然而這類藥物具有多靶點(diǎn)特性，服用后常伴發(fā)胃腸道功能障礙、呼吸抑制、藥物成癮、慢性毒性等不良反應(yīng)

。因此，明確介導(dǎo)炎性痛的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，對(duì)于精準(zhǔn)防治炎性痛具有重要意義。研究表明背根神經(jīng)節(jié)中多種離子通道的激活參與了外周痛覺敏化的形成

。DRG 神經(jīng)元上表達(dá)的TRPV1 和P2X3R 作為感受外界傷害性刺激的主要受體，被認(rèn)為與疼痛密切相關(guān)

，抑制DRG 中P2X3R 和TRPV1 表達(dá)可有效緩解炎性疼痛

。深入研究炎性痛大鼠不同時(shí)期健患側(cè)痛行為變化及其外周P2X3R 和TRPV1 表達(dá)差異，有助于進(jìn)一步明確介導(dǎo)炎性痛的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)和干預(yù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

方 法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Specific Pathogen Free 級(jí)健康SD 大鼠60 只，6 周齡，體重200 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK（浙）2018-0012]。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求（倫理審批號(hào)：IACUC-20190715-09）。

一段視頻回顧了安道麥16年發(fā)展的里程碑。在不到兩年的時(shí)間里，安道麥完成了和沙隆達(dá)的合并，國(guó)際領(lǐng)先的制劑中心、研發(fā)中心相繼投入使用。在中國(guó)的業(yè)務(wù)省份擴(kuò)大到28個(gè)，新上市產(chǎn)品18個(gè)，直接交易客戶超過700之眾，公司披露2017年報(bào)表，全球銷售突破220億元，中國(guó)區(qū)同比增長(zhǎng)41.6%，實(shí)現(xiàn)歷史最佳業(yè)績(jī)。視頻中一張張合作伙伴與安道麥員工一起活躍在田間地頭的照片引發(fā)了現(xiàn)場(chǎng)強(qiáng)烈共鳴。

實(shí)驗(yàn)儀器：

Frey hairs test 觸覺纖維絲、游標(biāo)卡尺、足底熱輻射測(cè)痛儀（37370，意大利UGO BASILE）；超聲波粉碎機(jī)（JY92-2，中國(guó)寧波新芝）；電泳-轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)BioRad）；凝膠成像系統(tǒng)（Fluor Chem R，美國(guó)Protein Simple）。

實(shí)驗(yàn)試劑和耗材：完全弗氏佐劑（F5881，美國(guó)Sigma）；P2X3R（APR016，美國(guó)Alomone）；TRPV1（ACC030，美國(guó)Alomone）；GAPDH（3683，美國(guó)CST）；山羊抗兔IgG H＆L（ab6721，美國(guó)Abcam）；BCA 試劑盒（P0010，中國(guó)碧云天）；ECL 試劑盒（P0018，中國(guó)碧云天）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

通過多年技術(shù)攻關(guān)與工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，進(jìn)一步掌握了降低拋渣含鉛的工藝過程控制參數(shù)，提高鉛冶煉有價(jià)金屬的回收率和直收率，降低作業(yè)成本，削減重金屬排放量，公司已實(shí)現(xiàn)拋渣(水淬渣)含鉛由2.19%降至0.44%，含鋅由5.70%降至2.88%，按年產(chǎn)生拋渣(水淬渣)30 000 t/a計(jì)，年削減拋渣(水淬渣)含鉛525 t/a、含鋅846 t/a，具有較好的環(huán)境、經(jīng)濟(jì)效益，為公司持續(xù)健康發(fā)展提供工藝技術(shù)保障。

檢測(cè)大鼠健患側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)足跖厚度變化評(píng)估足跖局部炎癥水腫狀態(tài)。如圖2 所示，兩組大鼠健患側(cè)基線 (BL) 足跖厚度并無差異。與同期Con-Ipsi組相比，CFA 大鼠患側(cè)足跖厚度于造模后各時(shí)間點(diǎn)均顯著增厚(

＜ 0.01)；且CFA 大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)患側(cè)足跖厚度均顯著高于CFA 大鼠健側(cè)足跖(

＜0.01)；兩組大鼠健側(cè)足跖厚度于造模后各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異。

3. 指標(biāo)檢測(cè)

為使得生成的圖形更加具有隨機(jī)性，在線段與角度繪制時(shí)，以當(dāng)前生長(zhǎng)點(diǎn)方向加上或者減去隨機(jī)值實(shí)現(xiàn)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)平滑側(cè)根的目的，也實(shí)現(xiàn)了角度變化的隨機(jī)性，使得生成圖形更加逼真、自然。

檢測(cè)大鼠健患側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)足跖MWT 判定機(jī)械痛覺異常。如圖4 所示，兩組大鼠健患側(cè)基礎(chǔ)MWT 無顯著差異。CFA 大鼠患側(cè)足跖MWT 造模后各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于同期Con-Ipsi 組(

＜ 0.01)；與CFA-Contra 組相比，CFA 大鼠患側(cè)足跖MWT 于造模后1、3、7、14 天和28 天時(shí)均顯著下降(

＜ 0.01)，于造模后42 天時(shí)無明顯差異；造模后28 天和42 天時(shí)，CFA 大鼠健側(cè)足跖MWT 顯著低于同期Con-Contra組與Con-Ipsi 組（

＜ 0.05 或

＜ 0.01）。

以10批護(hù)肝劑制劑指紋圖譜中39個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，運(yùn)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，選用組間聯(lián)接聚類方法，采用歐式距離度量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算樣品的相似性程度，聚類結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，10批護(hù)肝劑制劑分為4類，其中樣品編號(hào)2聚為一類，樣品編號(hào)6、10聚為一類，樣品編號(hào)4、5、8聚為一類，樣品編號(hào)3、9、7、1聚為一類。結(jié)果表明護(hù)肝劑質(zhì)量較為均一、穩(wěn)定，不同批次間的一致性較強(qiáng)，為護(hù)肝劑制劑療效的穩(wěn)定提供了保證。

（2）熱縮足反射潛伏期 (TWL)：待實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)環(huán)境3 天后再進(jìn)行痛行為學(xué)檢測(cè)。將實(shí)驗(yàn)組各大鼠分別置于不同的透明箱中，環(huán)境溫度需維持在25±2℃內(nèi)。待大鼠停止梳理毛發(fā)或舔足后，將足底熱輻射測(cè)痛儀上的“十”字圖案對(duì)準(zhǔn)大鼠后足足底中央，分別用熱輻射光照射大鼠左右兩側(cè)后足足底中央。開始照射時(shí)，儀器開始自動(dòng)計(jì)時(shí)；大鼠出現(xiàn)抬腿后，儀器停止自動(dòng)計(jì)時(shí)，記錄的時(shí)間為大鼠的TWL。共記錄5 次時(shí)間值，每次至少間隔5 min，取中位數(shù)及其前后兩個(gè)數(shù)值的均值為最終熱痛閾值。為了避免大鼠足跖皮膚灼傷，設(shè)置照射最長(zhǎng)時(shí)間為20 s，最高溫度為35℃。

（3）機(jī)械刺激縮足反射閾值 (MWT)：待實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)環(huán)境3 天后再進(jìn)行痛行為學(xué)檢測(cè)。測(cè)量時(shí)，放置大鼠方法同前。但透明箱安裝于鐵絲網(wǎng)上，方便暴露大鼠足底以供檢測(cè)。從4 g 刺激強(qiáng)度開始，使用不同力量的

Frey 絲（0.4、0.6、1、2、4、6、8、15、26 g）垂直刺激大鼠兩側(cè)后跖足底中部，施加壓力至

Frey 絲輕微彎曲“S”形并持續(xù)5 s，若大鼠出現(xiàn)縮腿或舔足反應(yīng)則為陽性反應(yīng)，記為“X”并給予相鄰小一級(jí)力度的刺激；當(dāng)該力度的

Frey纖維刺激不能引起陽性反應(yīng)時(shí)，則記為“O”并給予相鄰大一級(jí)力度刺激，每次刺激間隔30 s。當(dāng)出現(xiàn)第1 次陽性反應(yīng)后，再繼續(xù)刺激4 次，記錄下反應(yīng)序列，按照Chaplan 等方法計(jì)算MWT

。

主要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠不同時(shí)間點(diǎn)足跖部厚度、TWL 和MWT 及各組大鼠雙側(cè)L

-L

DRG 中P2X3R和TRPV1 蛋白表達(dá)情況；具體檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)見實(shí)驗(yàn)流程圖（見圖1）。

檢測(cè)大鼠健患側(cè)不同時(shí)間點(diǎn)足跖TWL 判定熱痛覺過敏。如圖3 所示，兩組大鼠健患側(cè)基礎(chǔ)TWL無顯著差異。與同期Con-Ipsi 組相比，CFA 大鼠患側(cè)足跖TWL 于造模后1、3、7 天和14 天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(

＜ 0.01)，造模后28、42 天未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與CFA-Contra 組相比，CFA 大鼠患側(cè)足跖TWL于造模后各時(shí)間點(diǎn)均顯著下降（

＜ 0.05或

＜ 0.01）；兩組大鼠健側(cè)足跖TWL 于造模后各時(shí)間點(diǎn)無明顯差異。

4. 圖像和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Image J 軟件計(jì)算條帶的灰度值，均一化處理目的與內(nèi)參條帶的比值作為最終統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。采用Graphpad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (

±

)表示。足趾厚度和行為學(xué)數(shù)據(jù)采用Two-way ANOVA 分析，免疫印跡結(jié)果多組間比較采用One-way ANOVA 分析，兩組組間采用獨(dú)立樣本

檢驗(yàn)。

＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組大鼠健患側(cè)足跖厚度變化

炎性痛模型制備：炎性痛組內(nèi)每只大鼠于左后足足底皮下注射 CFA 原液每只100 μl，建立炎性疼痛模型。

有學(xué)者在《解放區(qū)發(fā)展民辦小學(xué)的歷史考察》中對(duì)解放戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期小學(xué)教育進(jìn)行了一定的研究。解放區(qū)在革命戰(zhàn)爭(zhēng)激烈的環(huán)境里，掀起了發(fā)展民辦小學(xué)的熱潮。解放區(qū)的民辦小學(xué)是在 “民辦公助”方針的指引下發(fā)展起來的。這個(gè)方針的提出和當(dāng)時(shí)解放區(qū)正在進(jìn)行的小學(xué)教育改革分不開。民辦小學(xué)的發(fā)展加快了在解放區(qū)普及小學(xué)教育的步伐，體現(xiàn)了普及教育中的群眾路線。

2.各組大鼠健患側(cè)TWL 變化

（4）Western Blot 蛋白檢測(cè)：每組隨機(jī)選擇6只大鼠雙側(cè)L

-L

DRG，檢測(cè)P2X3R 和TRPV1 蛋白表達(dá)情況。于CFA 造模后1 天、14 天、28 天、42 天檢測(cè)完MWT、TWL、足跖部厚度后進(jìn)行取材。用3%戊巴比妥鈉(0.15 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室、升主動(dòng)脈快速灌注4℃預(yù)冷的生理鹽水，快速取出雙側(cè)L

-L

DRGs，置入-80℃冰箱中保存。將實(shí)驗(yàn)大鼠雙側(cè)L

-L

DRG裂解后提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行蛋白變性。根據(jù)指標(biāo)分子量選用8%分離膠、5%濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)印至甲醇激活的PVDF 膜。使用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，分別使用1X TBST 稀釋后兔抗P2X3R (1:1000)、兔 抗TRPV1 (1:1000)，4 ℃孵育過夜。隨后加入二抗，室溫?fù)u動(dòng)孵育2 h。使用ECL 發(fā)光試劑盒顯色拍片。

3.各組大鼠健患側(cè)MWT 變化

（1）足跖部厚度 (paw thickness)：實(shí)驗(yàn)大鼠均處于室溫25℃且安靜的環(huán)境中，固定大鼠的腿部使其充分暴露足跖部，使用游標(biāo)卡尺分別連續(xù)讀取3次大鼠健側(cè)和患側(cè)足跖部厚度（足背高點(diǎn)與足底的垂直高度），取3 次測(cè)量值均值為該足跖部厚度。

4.各組大鼠健患側(cè)L4-L6 DRG 中P2X3R 蛋白表達(dá)情況

如圖5 所示，與Con-Ipsi 組相比，CFA 大鼠患側(cè)L

-L

DRG 中P2X3R 蛋白表達(dá)于造模后1、14、28、42 天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯增加（

＜ 0.05 或

＜ 0.01）；造模后1 天和14 天時(shí)CFA 大鼠患側(cè)P2X3R 蛋白表達(dá)明顯高于同期CFA-Contra 組（

＜ 0.05 或

＜0.01），造模后28 天和42 天時(shí)與同期CFA-Contra組無明顯差異；與Con-Contra 組相比，CFA 大鼠健側(cè)P2X3R 蛋白表達(dá)于造模后1 天、14 天無明顯差異，但于造模后28 天、42 天時(shí)表達(dá)明顯增多(

＜ 0.05)。

5. 各組大鼠健患側(cè)L4-L6 DRG 中TRPV1 蛋白表達(dá)情況

如圖6 所示，與Con-Ipsi 組相比，CFA 大鼠患側(cè)L

-L

DRG 中TRPV1 蛋白表達(dá)于造模后各時(shí)間點(diǎn)均明顯增加(

＜ 0.05)；造模后各時(shí)間點(diǎn)CFA 大鼠患側(cè)TRPV1 蛋白表達(dá)明顯高于同期CFA-Contra 組（

＜0.05 或

＜ 0.01），造模后28 天時(shí)與同期CFA-Contra 組無明顯差異；與Con-Contra 組相比，CFA 大鼠健側(cè)TRPV1 蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化。

分組：除對(duì)照組 (Control, Con group) 外，炎性痛大鼠均行炎性痛造模處理。Con 組僅于相同足跖位置注射相同劑量0.9%氯化鈉溶液。所有實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(Con group,

= 12)和炎性痛 (CFA) 組(inflammatory pain group,

= 48)，其中炎性痛大鼠按照造模后4 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)分批取材，即CFA 1 天（炎性痛早期，

= 12），CFA 14 天(

= 12)、CFA 28 天(

= 12)、CFA 42 天(

= 12)，后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)為炎性痛晚期；Con 大鼠于造模后42 天取材。各組大鼠一半用于檢測(cè)機(jī)械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)、一半用于檢測(cè)熱縮足反射潛伏期 (thermal withdrawal latency, TWL) 。

討 論

炎性痛是常見的病理性疼痛之一，主要表現(xiàn)為機(jī)械痛覺異常和熱痛覺過敏等痛行為改變

。本研究動(dòng)態(tài)觀察了CFA 大鼠在炎性痛不同時(shí)期健患側(cè)足跖痛行為差異，首次觀測(cè)到CFA 造模后第42 天；并進(jìn)一步研究炎性痛不同時(shí)期DRG 中P2X3R 和TRPV1 在介導(dǎo)健患側(cè)痛行為中的作用差異，初步揭示CFA 致炎性痛大鼠健患側(cè)足跖痛行為表現(xiàn)存在時(shí)間差異，痛相關(guān)受體P2X3R 和TRPV1 介導(dǎo)痛行為角色有所不同。

本研究較系統(tǒng)觀察了造模后1 天至42 天期間CFA 大鼠健患側(cè)足跖炎癥和痛行為變化情況。CFA大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)患側(cè)足跖厚度均明顯增厚，提示CFA 大鼠患側(cè)足跖局部炎癥在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在。既往研究報(bào)道

，CFA 足底注射后足跖腫脹在2～3 周內(nèi)持續(xù)存在，而本研究結(jié)果提示CFA 大鼠患側(cè)足跖腫脹可至少持續(xù)6 周。實(shí)驗(yàn)中還觀察到CFA 大鼠患側(cè)足跖TWL 于造模后1 天開始下降并維持較低水平，炎性痛后期有所回升。已有研究與本研究結(jié)果類似，也觀察到熱痛覺過敏恢復(fù)現(xiàn)象，然而恢復(fù)時(shí)間稍有不同

。如Cui 等

研究結(jié)果顯示CFA 足底注射后引起的熱痛覺過敏在31 天恢復(fù)；Zaratin 等

研究報(bào)道CFA 足底皮內(nèi)注射誘導(dǎo)的單關(guān)節(jié)炎模型中，熱痛覺過敏在21 天恢復(fù)。本研究還觀察到CFA 大鼠患側(cè)MWT 于各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低，提示CFA 誘發(fā)的患側(cè)機(jī)械痛覺異?？稍谘仔酝丛缙诤屯砥诔掷m(xù)存在。既往大部分炎性痛相關(guān)研究通常僅觀察到CFA 造模后14 至21 天

，本研究觀察至造模后6 周，更全面地呈現(xiàn)了炎性痛大鼠的長(zhǎng)時(shí)程痛行為特征。CFA 誘導(dǎo)的痛行為特征在不同研究中有所差異，可能與其造模所用藥物的成分以及注射劑量的不同有關(guān)。本研究采用大鼠左足底皮下注射100 μl CFA 原液（1 mg 結(jié)核分枝桿菌溶于0.85 ml 石蠟油和0.15 ml 甘露醇單油酸酯混合物），Cui 等

注射100 μl CFA 原液與無菌生理鹽水等比例稀釋混合物進(jìn)行造模；Zaratin 等

則采用150 μl 以0.1%丁酸分枝桿菌為主要成分的CFA原液進(jìn)行造模。研究還觀察到CFA 大鼠于造模后28 天健側(cè)足跖出現(xiàn)機(jī)械痛覺異常，表明CFA 大鼠在炎性痛后期出現(xiàn)機(jī)械鏡像痛。與本研究結(jié)果相似，既往研究報(bào)道也在神經(jīng)病理性疼痛、炎性痛模型中觀察到機(jī)械鏡像痛痛現(xiàn)象

。然而CFA 大鼠健側(cè)足跖TWL與同期Con-Contra組相比無明顯差異，仍高于自身患側(cè)足跖（見圖3）。高永靜等

研究表明，SD 大鼠足底注射CFA 3 h 后即出現(xiàn)機(jī)械鏡像痛，未誘發(fā)出鏡像熱痛覺過敏；Raghavendra 等

和Nagakura 等

也觀察到此類現(xiàn)象，但機(jī)械鏡像痛出現(xiàn)的時(shí)間分別為CFA 造模14 天和10 天。據(jù)此，推測(cè)CFA 致炎性痛可誘發(fā)機(jī)械鏡像痛而非鏡像熱痛覺過敏，機(jī)械鏡像痛在炎性痛早期和晚期均有報(bào)道，有待進(jìn)一步研究明確。

P2X3R 和TRPV1 均是介導(dǎo)炎癥性疼痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)

。有研究表明，足底CFA 注射可使DRG 中小傷害性神經(jīng)元中P2X3R 表達(dá)顯著增多

；足跖或DRG 注射P2X3R 拮抗劑可有效拮抗炎性痛

。siRNA 轉(zhuǎn)染、藥理學(xué)下調(diào)或抑制DRG 神經(jīng)元TRPV1表達(dá)和激活可有效緩解炎性痛

。為進(jìn)一步揭示P2X3R 和TRPV1 在CFA 致炎性痛不同時(shí)期中的作用差異，本研究觀察到CFA 大鼠于造模后各時(shí)點(diǎn)患側(cè)DRG 中P2X3R、TRPV1 蛋白表達(dá)明顯多于Con-Ipsi 組（見圖5）；健側(cè)DRG 中僅P2X3R 蛋白于造模后28 天和42 天時(shí)表達(dá)明顯增多（見圖5），而健側(cè)TRPV1 蛋白表達(dá)無變化（見圖6）。以上結(jié)果表明，P2X3R 而非TRPV1 介導(dǎo)CFA 大鼠機(jī)械鏡像痛的產(chǎn)生，但健側(cè)DRG 中P2X3R 表達(dá)增多的內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。既往初步研究表明，抑制脊髓P2X3R 表達(dá)可緩解蜂毒誘導(dǎo)的鏡像痛

，患側(cè)肌肉注射P2X3R 拮抗劑A-317491 可有效緩解CFA 致咬肌炎癥大鼠的機(jī)械鏡像痛

。鞘內(nèi)注射P2X3R 拮抗劑是否可以緩解CFA 大鼠雙側(cè)足跖機(jī)械痛覺異常尚未有相關(guān)報(bào)道?？紤]到鞘內(nèi)注射存在藥物擴(kuò)散和脊髓腔內(nèi)腦脊液回流現(xiàn)象，不能完全排除P2X3R抑制劑擴(kuò)散至對(duì)側(cè)DRG 和脊髓背角的可能。目前本課題組正在探索單側(cè)DRG 注射技術(shù)，相關(guān)研究結(jié)果后續(xù)將進(jìn)一步予以報(bào)道。關(guān)于鏡像痛的發(fā)生機(jī)制仍不清楚，有研究認(rèn)為疼痛信號(hào)可通過激活患側(cè)膠質(zhì)細(xì)胞傳遞至健側(cè)，增強(qiáng)健側(cè)神經(jīng)元的興奮性從而誘發(fā)鏡像痛；抑制脊髓和DRG 中膠質(zhì)細(xì)胞活化則可緩解鏡像痛

。在脊神經(jīng)結(jié)扎模型中，患側(cè)DRG 中TNF-α 分泌增加并通過腦脊液向健側(cè)擴(kuò)散，健側(cè)DRG 中的衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (satellite glial cell,SGC) 被TNF-α 激活，激活的SGC 釋放神經(jīng)生長(zhǎng)因子以增強(qiáng)傷害感受器興奮性，從而誘導(dǎo)鏡像痛

。Krajewski 等

的研究結(jié)果顯示，在CFA 誘導(dǎo)的炎性疼痛模型中，雙側(cè)DRG中TNF-α表達(dá)均顯著升高。Jin 等

認(rèn)為TNF-α 誘導(dǎo)的機(jī)械痛覺異常可能由P2X3R 介導(dǎo)，TNF-α 可以使感覺神經(jīng)元上P2X3R迅速致敏誘發(fā)疼痛。此外， CFA 大鼠患側(cè)足跖熱痛覺過敏于造模后28 天有所回升，但患側(cè)DRG 中TRPV1 蛋白表達(dá)仍處于較高水平。究其原因，認(rèn)為DRG 中TRPV1 不僅參與熱痛覺過敏過程，還介導(dǎo)機(jī)械痛覺異常的產(chǎn)生

。與本研究結(jié)果相似，Xiao 等

研究觀察到，CFA 誘導(dǎo)的熱痛覺過敏在造模后14 天恢復(fù)，但患側(cè)DRG 中TRPV1 蛋白表達(dá)在造模后28 天仍高于空白對(duì)照組；在TRPV1 敲除小鼠中CFA 或辣椒素誘導(dǎo)的熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺異常均得到有效緩解

。P2X3R 與TRPV1 之間存在相互作用，兩者可以相互促進(jìn)對(duì)方的表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)疼痛

。

綜上所述，CFA 誘導(dǎo)的炎性痛大鼠模型中，患側(cè)機(jī)械痛覺異?？芍辽倬S持42 天，患側(cè)熱痛覺過敏同步出現(xiàn)，但于炎性痛后期恢復(fù)，同時(shí)造模后28天出現(xiàn)機(jī)械鏡像痛。CFA 大鼠患側(cè)足跖外周痛敏化發(fā)生和維持，與患側(cè)DRG 中P2X3R 和TRPV1 蛋白表達(dá)增加有關(guān)，而機(jī)械鏡像痛的產(chǎn)生可能與DRG中的P2X3R 有關(guān)。背根神經(jīng)元P2X3R 或可成為深入研究炎性痛后期鏡像痛的突破點(diǎn)。但本研究?jī)H通過檢測(cè)P2X3R 和TRPV1 的蛋白表達(dá)變化探索其在炎性痛維持和發(fā)生中的作用，缺乏藥理學(xué)干預(yù)等方法驗(yàn)證，本課題組正在開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過干預(yù)P2X3R 和TRPV1 表達(dá)進(jìn)一步探究其對(duì)炎性痛大鼠痛行為的影響。

加點(diǎn)準(zhǔn)則Cpof(·)選擇在可行性概率最大的地方添加試驗(yàn)點(diǎn)，選取可行試驗(yàn)點(diǎn)的效率非常高?；趦赡繕?biāo)約束應(yīng)對(duì)策略和加點(diǎn)準(zhǔn)則ISCbi的代理優(yōu)化算法(稱為EI-PoF算法)的具體流程如圖1所示。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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