徐斌 付玲鈺 張波 吳輝 張旭乾

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院 1.骨科；2.健康管理中心；3.病理科，四川 南充 637000)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，每年全球新發(fā)病例約為400萬[1-4]。骨肉瘤早期診斷較困難，目前新輔助化療聯(lián)合腫瘤切除術(shù)是骨肉瘤的主要治療方法，但預(yù)后較差[5-7]。盡管骨肉瘤的治療手段不斷更新，但是轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者死亡率仍然很高，總生存率低于20%[8-10]。骨肉瘤患者預(yù)后差的原因是其發(fā)病機(jī)制尚不清楚且存在爭議，因此進(jìn)一步研究骨肉瘤增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)就顯得非常重要。BTG2是BTG/TOB家族中的關(guān)鍵基因，與包括腫瘤在內(nèi)的多種生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)[11]。既往研究發(fā)現(xiàn)BTG2在多種腫瘤組織中低表達(dá)[12-14]，也有研究證實(shí)BTG2在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平明顯降低[15]，提示BTG2可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，然而BTG2對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響及其上游調(diào)控機(jī)制尚不明確。本研究深入探討了BTG2在骨肉瘤發(fā)病中的作用及其上游調(diào)控機(jī)制，以期為骨肉瘤的早期診斷和治療提供新的生物標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人骨肉瘤細(xì)胞株，正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞株和3種人骨肉瘤細(xì)胞株(HOS、MG63和Saos-2)購自美國種質(zhì)保藏中心。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12(Gibco，Carlsbad，USA)培養(yǎng)hFOB1.19細(xì)胞。三種骨肉瘤細(xì)胞在含有100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco)中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃，并含有5% CO2。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor及BTG2 siRNA(5′-GCUCCAUCUGCGUCUUGUA-3′)購自RiboBio公司 (Guangzhou，China)，circ0000781過表達(dá)載體PcDNA3.1- circ0000781質(zhì)粒和BTG2過表達(dá)載體PcDNA3.1- BTG2質(zhì)粒購自GeneChem公司 (Shanghai，China)。根據(jù)制造商的說明，使用Lipofectamine 2000試劑(Life Technologies，Carlsbad，USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 qRT-PCR 根據(jù)制造商說明書使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細(xì)胞中提取總RNA，再應(yīng)用Primescript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，Otsu，Shiga，Japan)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix(Applied Biosystems，美國)對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。BTG2引物序列如下:5′-GCGTGAGCGAGCAGAGGCTT-3′(forward)，5′-GGCTGGCCACCCTGCTGATG-3′(reverse)。miR-21-5p引物序列如下:5′-CTTACTTCTCTGTGTGATTTCTGTG-3′(forward)，5′-ACAACCTTTCCAAAATCCATGAGGC-3′(reverse)。采用2-△△Ct法記錄mRNA相對表達(dá)水平。

1.4 CCK-8 CCK-8用于檢測細(xì)胞增殖能力。將處理過的細(xì)胞用胰蛋白酶消化后接種到96孔板(每孔約2000個(gè)細(xì)胞)，每組5個(gè)重復(fù)。用CCK8分析不同時(shí)間點(diǎn)(接種后24、48和72 h)的細(xì)胞增殖活性。

1.5 Transwell 按照制造商的說明(BD Biosciences，Bedford，MA，USA)，將預(yù)涂有Matrigel的Transwell小室用于細(xì)胞侵襲分析。1×105處理過的OS細(xì)胞添加到上室，600 ul培養(yǎng)基添加到下室，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。在倒置光學(xué)顯微鏡下(Zeiss，Primovert)隨機(jī)取三個(gè)視野計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫使用 通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Targetscan(http://www. targetscan. org/vert_71/)篩選可與BTG2靶向結(jié)合的miRNA，再通過Circular RNA Interactome(https://circinteractome. nia. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測可與miR-21-5p靶向結(jié)合的circRNA。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)含有circ0000781野生型序列和突變型序列及BTG2野生型序列和突變型序列的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(Shanghai GeneChem Co)。將骨肉瘤細(xì)胞與報(bào)告質(zhì)粒和miR-21-5p mimic或陰性對照模擬物(NC)共轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)24 h，然后用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega)測定熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá) PCR結(jié)果顯示，與正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞株(0.99±0.07)相比，骨肉瘤HOS(0.65±0.05)、MG63(0.42±0.04)和Saos-2(0.71±0.06)細(xì)胞中BTG2表達(dá)水平明顯降低，在MG63細(xì)胞中的表達(dá)水平最低，故選擇MG63細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1。

圖1 BTG2在細(xì)胞株中表達(dá)水平Figure 1 BTG2 expression level in cell lines

2.2 BTG2對細(xì)胞增殖的影響 通過PcDNA3.1- BTG2質(zhì)粒在MG63細(xì)胞中過表達(dá)BTG2，與空載組和空白對照組相比，BTG2過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 過表達(dá)BTG2對細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of overexpression of BTG2 on cell proliferation

2.3 BTG2對細(xì)胞侵襲的影響 通過Transwell法發(fā)現(xiàn)，與空載組(92.67±5.15)和空白對照組(94.33±4.04)相比，BTG2過表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力明顯降低(36.33±2.52)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BTG2對細(xì)胞侵襲的影響Figure 2 Effect of BTG2 on invasion

2.4 BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合 通過Targetscan發(fā)現(xiàn)miR-21-5p含有BTG2的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合，見圖3、圖4。

圖3 miR-21-5p與BTG2結(jié)合位點(diǎn)Figure 3 Binding site of miR-21-5p and BTG2

圖4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Luciferase reporter gene assay

2.5 miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2 在MG63細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic過表達(dá)miR-21-5p，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組(miR-21-5p mimic NC)和空白對照組(Blank)相比(分別為1.00±0.08，0.97±0.06)相比，miR-21-5p過表達(dá)組中BTG2表達(dá)水平明顯降低(0.59±0.04)，說明miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2的表達(dá)，見圖5。

圖5 miR-21-5p負(fù)調(diào)控BTG2表達(dá)Figure 5 miR-21-5p negatively regulates BTG2 expression

2.6 miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖 為證實(shí)miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖，本研究設(shè)立對照組，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過表達(dá)組，檢測細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示與對照組和miR-21-5p mimic NC組相比，miR-21-5p mimic組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，但是與miR-21-5p mimic組相比，miR-21-5p mimic+BTG2過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力則有所降低，說明BTG2可逆轉(zhuǎn)miR-21-5p對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，見表2。

表2 miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞增殖Table 2 miR-21-5p promoted cell proliferation by negatively regulate BTG2

2.7 miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲 為證實(shí)miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲，本研究設(shè)立對照組，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2過表達(dá)組，檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示與對照組(39.00±2.00)和miR-21-5p mimic NC組(37.67±4.51)相比，miR-21-5p mimic組(84.00±3.00)細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，但是與miR-21-5p mimic組相比，miR-21-5pmimic+ BTG2過表達(dá)組(64.67±4.04)細(xì)胞侵襲能力則有所降低，說明miR-21-5p對細(xì)胞侵襲的促進(jìn)作用可被BTG2逆轉(zhuǎn)，見圖6。

圖6 miR-21-5p通過負(fù)調(diào)控BTG2促進(jìn)細(xì)胞侵襲Figure 6 miR-21-5p promoted cell invasion by negatively regulate BTG2

2.8 circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合 通過Circular RNA Interactome發(fā)現(xiàn)，circ0000781含有miR-21-5p結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合，見圖7、圖8。

圖7 circ0000781與miR-21-5p可能結(jié)合位點(diǎn)Figure 7 Binding site of circ0000781 and miR-21-5p

圖8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 8 Luciferase reporter gene assay

2.9 circ0000781負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá) 通過PcDNA3.1-circ0000781質(zhì)粒在MG63細(xì)胞中過表達(dá)circ0000781，發(fā)現(xiàn)與空載組(Vector)和空白對照組(Blank)相比(分別為1.03±0.04，0.97±0.06)，circ0000781過表達(dá)組miR-21-5p表達(dá)水平明顯降低(0.60±0.07)，證實(shí)circ0000781可下調(diào)miR-21-5p表達(dá)，見圖9。

圖9 circ0000781負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá)Figure 9 circ0000781 negatively regulates miR-21-5p expression

2.10 circ0000781通過負(fù)調(diào)控miR-21-5p上調(diào)BTG2表達(dá) 本研究設(shè)立對照組，circ0000781過表達(dá)組，PcDNA3.1-circ0000781 NC(空載組)組及circ0000781過表達(dá)+miR-21-5p mimic組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組(0.70±0.07)和空載組(0.72±0.06)相比，circ0000781過表達(dá)組中BTG2表達(dá)水平明顯增高(0.90±0.06)，但是與circ0000781過表達(dá)組相比，circ0000781過表達(dá)+miR-21-5p mimic組中BTG2表達(dá)水平則有所降低(0.79±0.04)，說明miR-21-5p可逆轉(zhuǎn)circ0000781對BTG2表達(dá)的促進(jìn)作用，見圖10。

圖10 circ0000781通過負(fù)調(diào)控miR-21-5p上調(diào)BTG2表達(dá)Figure10 circ0000781 upregulated BTG2 expression by negatively regulate miR-21-5p

3 討論

BTO/TOB家族是20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抗增殖蛋白家族。既往研究發(fā)現(xiàn)BTG2在多種組織中均有表達(dá)，參與細(xì)胞分化、增殖、DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡等多種生物活性。研究表明BTG2可使細(xì)胞周期阻滯在G0和G1期從而抑制細(xì)胞增殖，也有研究發(fā)現(xiàn)BTG2可通過調(diào)控p38和MAPK信號通路下調(diào)口腔鱗癌細(xì)胞增殖活性[16-17]。Gu等[15，18]的研究證實(shí)BTG2在骨肉瘤組織中低表達(dá)，并且BTG2可通過PI3K-AKT信號通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究也發(fā)現(xiàn)BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平相比于正常人成骨細(xì)胞明顯降低，并且過表達(dá)BTG2可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，證實(shí)BTG2在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的角色，與既往結(jié)果相符，表明BTG2是一個(gè)極具前景的骨肉瘤治療新靶點(diǎn)。

雖然本研究表明BTG2在骨肉瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用，然而調(diào)控其表達(dá)的上游機(jī)制尚不明確。miRNA是一類單鏈非編碼小RNA(18-25nt)，它們廣泛存在于真核生物中并可與靶基因的3-UTR結(jié)合，通過mRNA降解或翻譯抑制負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[19]。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Targetscan我們發(fā)現(xiàn)BTG2 mRNA的3-UTR中含有miR-21-5p的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告基因法證實(shí)BTG2可與miR-21-5p靶向結(jié)合。miR-21-5p對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用已得到廣泛的證實(shí)。如miR-21-5p通過靶向SMAD7促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲，并且miR-21-5p在復(fù)發(fā)性胃癌中高表達(dá)，可作為胃癌的潛在預(yù)后因子[20-21]。除此之外Zhang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p在骨肉瘤組織中高表達(dá)，然而miR-21-5p在骨肉瘤中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21-5p可負(fù)調(diào)控BTG2的表達(dá)，miR-21-5p還可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，然而miR-21-5p對骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用可被BTG2逆轉(zhuǎn)，證實(shí)miR-21-5p作為癌基因通過抑制抑癌基因BTG2的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

進(jìn)一步我們探討了miR-21-5p的上游調(diào)控基因?；诃h(huán)狀 RNA(circularRNAs，circRNAs)在腫瘤中的重要作用及其與microRNA的密切關(guān)系，我們將目光轉(zhuǎn)向circRNAs。circRNA是一類雙鏈閉合 RNA，其 3′和 5′末端連接形成共價(jià)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大部分屬于非編碼RNA[23]。研究表明，circRNA 在腫瘤中可以作為“海綿”來阻斷及競爭性抑制 miRNA 來發(fā)揮作用，因此circRNA可以作為內(nèi)源性競爭 RNA 參與腫瘤的發(fā)病[24]。鑒于circRNA 在腫瘤發(fā)生中的重要作用，我們通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Circular RNA Interactome篩選可與miR-21-5p靶向結(jié)合的circRNA，發(fā)現(xiàn)circ0000781含有miR-21-5p結(jié)合位點(diǎn)，接下來的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ0000781可與miR-21-5p靶向結(jié)合，并且circ0000781可負(fù)調(diào)控miR-21-5p表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)circ0000781可上調(diào)BTG2的表達(dá)，但是過表達(dá)miR-21-5p后BTG2的表達(dá)水平則明顯降低，說明miR-21-5p可逆轉(zhuǎn)circ0000781對BTG2表達(dá)的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，BTG2在骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)并可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。進(jìn)一步在探尋BTG2上游調(diào)控機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)circ0000781可作為海綿競爭性抑制miR-21-5p的表達(dá)，最終通過上調(diào)BTG2的表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖活性和侵襲能力。這表明circ0000781/miR-21-5p/BTG2信號軸可作為骨肉瘤治療的潛在作用靶點(diǎn)。