黃鈺媛 韋雪梅 鄭育秀 劉麗麗

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，海南 ?？?570311)

外科手術(shù)中全身麻醉起效快，可迅速引起患者意識(shí)、感覺(jué)和反射可逆性消失，骨骼肌松弛[1]。然而，老年患者因常伴有心、腦、肺等多個(gè)臟器的生理性功能衰退，全身麻醉會(huì)帶來(lái)一系列不良反應(yīng)[2]。氯胺酮與七氟醚分別用于全身麻醉中吸入型和靜脈注射型麻醉，常在髖關(guān)節(jié)置換術(shù)[3]、腫瘤切除等手術(shù)中應(yīng)用[4]。全身麻醉會(huì)增加老年患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)的風(fēng)險(xiǎn)[5]，這嚴(yán)重限制了其在老年人手術(shù)中的應(yīng)用。但是多數(shù)手術(shù)無(wú)法避免全麻，因此需要一項(xiàng)針對(duì)氯胺酮與七氟醚誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙的比較研究，為臨床中麻醉方式、藥物的選擇甚至進(jìn)一步的聯(lián)合應(yīng)用提供一些理論基礎(chǔ)。Aβ屬于細(xì)胞毒性多肽，可促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞活化，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)Tau蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，進(jìn)而引起神經(jīng)元死亡與樹(shù)突棘的萎縮[6]。而老齡患者海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘萎縮會(huì)阻滯神經(jīng)信號(hào)傳遞，最終導(dǎo)致記憶的存儲(chǔ)與記憶的障礙[7]?；贏β沉積與樹(shù)突棘萎縮都是小鼠認(rèn)知功能損傷的原因，本研究擬構(gòu)建氯胺酮靜脈注射型與七氟醚吸入型全麻模型，比較兩種麻醉方式對(duì)腦組織中Aβ斑塊沉積和神經(jīng)元樹(shù)突棘狀態(tài)的影響，分析小鼠POCD的嚴(yán)重程度，為臨床上全麻的選擇提供一些指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只C57BL/6小鼠，12月齡，體質(zhì)量35～40 g，由海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜循環(huán)，(22±2)℃恒溫空間，充足食物、水源。所有涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)方案均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，且本實(shí)驗(yàn)研究方案已獲得海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案 將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，七氟醚組與氯胺酮組，每組12只，開(kāi)始水迷宮測(cè)試。小鼠禁食12 h后，靜脈注射氯胺酮(浙江九旭藥業(yè)有限公司)或者吸入七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司)麻醉，麻醉時(shí)間維持在6 h以上。參考預(yù)實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)中報(bào)道[8-9]，七氟醚麻醉方案：3%七氟醚持續(xù)通入麻醉盒中，維持180 min。氯胺酮麻醉方案：0 min時(shí)注射80 mg/kg，30 min時(shí)注射40mg/kg，90 min時(shí)注射40 mg/kg，180 min時(shí)注射40 mg/kg，總劑量200 mg/kg。麻醉完成后2周，開(kāi)始水迷宮測(cè)試，隨后CO2處死，取腦組織用于長(zhǎng)時(shí)程電位測(cè)試，高爾基染色，免疫組化染色，Western blot。

1.3 Morris水迷宮測(cè)試 水迷宮裝置(江蘇賽昂斯生物技術(shù)公司，型號(hào)：SA201)是直徑1.2 m，深50 cm的圓形水池，分為4個(gè)象限。第Ⅰ象限中央設(shè)置一個(gè)低于水面1 cm的圓形平臺(tái)，直徑12 cm。四周貼有不同圖形幫助小鼠定位。麻醉后14 d開(kāi)始，每天將小鼠自各個(gè)象限依次投入水中，記錄90 s內(nèi)尋找到平臺(tái)的時(shí)間，取平均時(shí)間記為當(dāng)日逃避潛伏期。訓(xùn)練4天后，撤去平臺(tái)，將小鼠自第Ⅲ象限投入水中，記錄90 s內(nèi)小鼠運(yùn)行軌跡，計(jì)算機(jī)分析小鼠平均游泳速率、首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間。

1.4 長(zhǎng)時(shí)程電位測(cè)試 小鼠以CO2處死后，用氧飽和高糖切片液心臟灌流，取完整腦組織，修塊后固定于切片機(jī)上切片。轉(zhuǎn)移腦組織切片至32℃的氧飽和人工腦脊液(ACSF，北京酷來(lái)搏科技有限公司)中。取出海馬切片，自內(nèi)側(cè)穿通路(The medial perforant path，MPP)插入刺激電極，在海馬 DG區(qū)插入記錄電極，充灌 ACSF作為記錄電極內(nèi)液。電極連接MultiClamp 700B放大器，記錄興奮性突觸后電位(Excitatory postsynaptic potential，EPSP)；不斷調(diào)整調(diào)整刺激強(qiáng)度和記錄電極的位置和深度，用 0.033 Hz的刺激頻率誘發(fā)場(chǎng)電位(Filed EPSP，fEPSP)直到記錄典型的場(chǎng)電位波形，然后固定刺激強(qiáng)度與記錄電極。在基線穩(wěn)定記錄20 min后，以高頻刺激誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long term potentiation，LTP)，連續(xù)20串高頻脈沖，每串包含200個(gè)脈沖，頻率為200 Hz，波寬200 μs，串間隔30 s，高頻刺激連續(xù)記錄60 min。

1.5 高爾基染色及計(jì)數(shù) 小鼠以CO2處死后，取完整腦組織浸泡于溶液1、溶液2混合液中(溶液1、2及下面提到的溶液3、4、5均來(lái)自于美國(guó)Hitobiotec公司生產(chǎn)的Hito Golgi-Cox Optimstain Kit高爾基染色試劑盒)，4℃避光孵育14天。取出腦組織浸入5倍體積的溶液3中，4℃避光孵育12 h后更換等量溶液3，4℃下繼續(xù)孵育48 h。將腦組織放入預(yù)冷的異戊烷中冷凍，冰凍切片機(jī)將組織切成10 μm切片，轉(zhuǎn)移至滴有溶液3的載玻片中貼片，放入溶液4、5混合溶液中反應(yīng)30 min。將玻片以梯度酒精脫水，經(jīng)二甲苯透化后封片。使用顯微鏡(日本奧林巴斯科技公司，型號(hào)：BX53)捕獲圖像。

1.6 免疫組化染色 小鼠以CO2處死后，生理鹽水心臟灌流，取腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，再經(jīng)梯度酒精脫水，以二甲苯透化，石蠟包埋后切片，厚度約10 μm。取切片，高溫烘烤15 min修復(fù)抗原，將切片置于4%胎牛血清封閉液中封閉2 h，加入Anti-Aβ抗體稀釋液[1:100，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出切片，PBST清洗并加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體稀釋液[1:2000，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]，4℃條件下避光孵育2 h。PBST洗滌切片，DAB顯色30 s，再次使用蘇木精復(fù)染20 s，蒸餾水分化，在不同梯度酒精中脫水，二甲苯透化后封片，顯微鏡下觀察拍片。

1.7 Western blot 小鼠以CO2處死后，取海馬組織，加入RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，研磨成細(xì)胞懸液，12000 rpm離心20 min，加入上樣緩沖液。取出凝膠上樣梳，每孔加入約10 μg樣品。設(shè)置電泳條件：60 V/30 min，120 V/60 min，以上樣緩沖液到達(dá)凝膠底部為電泳終點(diǎn)。截取目標(biāo)蛋白條帶，濕法轉(zhuǎn)膜法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件：2 mA/60 min，整個(gè)過(guò)程冰水浴。取出PVDF膜，4%胎牛血清封閉，以目的蛋白一抗稀釋液孵育PVDF膜，4℃過(guò)夜，包括Anti-NMDAR1，Anti-NMDAR2A，Anti-NMDAR2B，Anti-Caspase-3，Anti-bcl-2，Anti-bax(1:1000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。次日，取出PVDF膜，HRP標(biāo)記IgG(H+L)二抗稀釋液(1:5000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)孵育2 h。將發(fā)光液滴加的PVDF膜上，顯影儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：1600/1600R)下顯影獲得蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠Morris水迷宮指標(biāo)的影響 Morris水迷宮結(jié)果顯示，訓(xùn)練期間，隨著時(shí)間的推移，各組小鼠逃避潛伏期都出現(xiàn)了一定程度降低。麻醉前，各組小鼠之間逃避潛伏期沒(méi)有差異；麻醉后，自第3天起，與對(duì)照組相比，氯胺酮組與七氟醚組小鼠逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，且氯胺酮組小鼠逃避潛伏期低于七氟醚組。測(cè)試中，麻醉前各組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)均沒(méi)有差異；麻醉后，各組小鼠雖然游泳速率沒(méi)有差異，但與對(duì)照組相比，氯胺酮組與七氟醚組小鼠首次到達(dá)平臺(tái)時(shí)間明顯增加(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時(shí)間與穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與此同時(shí)，測(cè)試中氯胺酮組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)，雖然沒(méi)有明顯性差異，但全部都優(yōu)于七氟醚組。見(jiàn)圖1～3。

圖1 各組小鼠訓(xùn)練期間逃避潛伏期的變化(n=12)Figure 1 Changes in escape latency of mice in each group during training

圖2 各組小鼠測(cè)試期間Morris水迷宮軌跡圖(n=12)Figure 2 Morris water maze trajectory of mice in each group during test

圖3 各組小鼠測(cè)試期間Morris水迷宮指標(biāo)的變化(n=12)Figure 3 Changes in Morris water maze indexes of mice in each group during test

2.2 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠神經(jīng)元突觸狀態(tài)的影響 高爾基染色顯示，對(duì)照組小鼠神經(jīng)元突觸豐富且樹(shù)突棘密集。與對(duì)照組相比，氯胺酮與七氟醚都造成了小鼠神經(jīng)元中樹(shù)突棘密度和樹(shù)突棘長(zhǎng)度降低(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚造成樹(shù)突棘密度降低，且樹(shù)突棘長(zhǎng)度明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠神經(jīng)元樹(shù)突棘狀態(tài)(高爾基染色，1000×，n=3)Figure 4 Dendritic spines of mice in each group

2.3 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠長(zhǎng)時(shí)程電位的影響 長(zhǎng)時(shí)程電位測(cè)試顯示，與對(duì)照組相比，氯胺酮與七氟醚都造成了小鼠MPP-DG回路的fEPSP斜率降低(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚組小鼠MPP-DG回路中fEPSP斜率更低(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠長(zhǎng)時(shí)程電位的變化(n=3)Figure 5 Changes in long-term potential of mice in each group

2.4 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠Aβ沉淀的影響 免疫組化染色顯示，對(duì)照組小鼠腦組織中幾乎沒(méi)有Aβ沉淀。氯胺酮與七氟醚誘導(dǎo)小鼠，無(wú)論是皮層還是海馬區(qū)，都造成了Aβ沉積明顯增加(P<0.05)；與氯胺酮組相比，七氟醚造成皮層和海馬區(qū)Aβ沉積增加，且海馬區(qū)Aβ沉積具有明顯差異(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠腦組織中Aβ沉積(免疫組化染色，10×，40×，n=3)Figure 6 Aβ deposition in brain of mice in each group

2.5 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠NMDA受體的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氯胺酮與七氟醚造成了NMDAR表達(dá)降低(P<0.05)；與七氟醚組相比，氯胺酮對(duì)NMDAR表達(dá)的降低作用更明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組小鼠海馬中NMDAR表達(dá)(n=3)Figure 7 NMDAR expression in hippocampus of mice in each group

2.6 氯胺酮與七氟醚對(duì)老齡小鼠Caspase-3凋亡信號(hào)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氯胺酮與七氟醚造成了Caspase-3表達(dá)升高，bcl-2表達(dá)降低，bax表達(dá)升高(均P<0.05)；與七氟醚組相比，氯胺酮組bcl-2表達(dá)更高(P<0.05)。見(jiàn)圖8。

圖8 各組小鼠海馬中Caspase-3凋亡信號(hào)蛋白的表達(dá)(n=3)Figure 8 The expression of Caspase-3 apoptotic signal protein in hippocampus of mice in each group

3 討論

氯胺酮與七氟醚是臨床常用全麻藥物。七氟醚是一種無(wú)色透明，無(wú)刺激性易揮發(fā)的液體，患者戴上面罩吸入濃度為3%～6%七氟醚2 min，即會(huì)出現(xiàn)意識(shí)消失的情況[10]。氯胺酮一種無(wú)色透明液體，具有強(qiáng)效的陣痛作用，且安全性較高，麻醉過(guò)程易管理[11]。已有較多研究比較了兩者在髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，疝囊高位結(jié)扎術(shù)等手術(shù)中的麻醉效果[12-13]。與氯胺酮相比，七氟醚具有多方面優(yōu)勢(shì)，如術(shù)前誘導(dǎo)期較為平靜、術(shù)中血液動(dòng)力學(xué)較為穩(wěn)定，肌松藥使用較少，術(shù)后蘇醒較快[14-15]。然而，兩種麻醉藥物在POCD的研究中卻鮮有比較。

POCD是以學(xué)習(xí)記憶能力損傷為特征的并發(fā)癥。Morris水迷宮中，小鼠以空間四周標(biāo)記作為參照物，經(jīng)反復(fù)訓(xùn)練，在其腦中形成空間參考記憶，能夠借助參照物來(lái)辨別方位，登上逃生平臺(tái)[16]。本研究中，麻醉前各組小鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能相似，但經(jīng)歷了七氟醚或氯胺酮麻醉后的小鼠各項(xiàng)指標(biāo)都明顯劣于對(duì)照組小鼠，提示本研究小鼠認(rèn)知功能障礙模型構(gòu)建成功。與七氟醚組相比，雖然沒(méi)有明顯性差異，但氯胺酮麻醉小鼠Morris水迷宮各項(xiàng)指標(biāo)中都優(yōu)于七氟醚組。

突觸是神經(jīng)元之間功能聯(lián)系的接觸點(diǎn)，是信息傳遞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。突觸通過(guò)樹(shù)突棘的增加和萎縮使信息傳遞效率發(fā)生變化，因此，樹(shù)突棘數(shù)量、密度、長(zhǎng)度的變化可反應(yīng)突觸可塑性變化[17]。突觸可塑性指突觸基于樹(shù)突棘結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不斷變化的傳遞效能，與個(gè)體的學(xué)習(xí)和記憶能力相關(guān)[18]。以往探索中，POCD患者腦組織中都有發(fā)現(xiàn)樹(shù)突棘萎縮[19]，而新生幼鼠中，樹(shù)突棘密度往往隨著腦組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育而增加[20]。宏觀上，海馬區(qū)LTP效應(yīng)也反映了突觸可塑性，與認(rèn)知行為有明顯相關(guān)性[21]。Sakusic等[22]分析顯示提高學(xué)習(xí)和記憶的因素往往能誘發(fā)LTP；反之，抑制LTP的因素也能影響學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程。本研究中，氯胺酮與七氟醚組中可見(jiàn)明顯的樹(shù)突棘密度與長(zhǎng)度降低，且LTP水平明顯降低，反映了氯胺酮與七氟醚組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力的損傷，七氟醚對(duì)樹(shù)突棘密度和LTP水平的影響都要明顯高于氯胺酮組，也反映了七氟醚造成的學(xué)習(xí)與記憶能力損傷要高于氯胺酮。

Aβ是β和γ分泌酶對(duì)淀粉樣前體蛋白連續(xù)水解和切割的產(chǎn)物，是阿爾茲海默病認(rèn)知功能障礙進(jìn)展的病理基礎(chǔ)[23]。氯胺酮與七氟醚組小鼠腦組織中可見(jiàn)明顯的Aβ斑塊沉積。在海馬組織中，與氯胺酮組相比，七氟醚造成海馬區(qū)Aβ沉積明顯增加。有研究證實(shí)，老齡患者早期輕度認(rèn)知功能損傷是由于寡聚態(tài)Aβ的聚集引起的突觸功能障礙所致，并且這種寡聚體Aβ的沉積現(xiàn)象的出現(xiàn)是早于廣泛的突觸喪失和神經(jīng)變性之前[24]。由于海馬區(qū)是影響動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶能力的生理區(qū)域，因此海馬區(qū)Aβ增加是造成神經(jīng)元樹(shù)突棘萎縮，LTP強(qiáng)度降低的主要原因，也是導(dǎo)致七氟醚組小鼠學(xué)習(xí)與記憶功能劣于氯胺酮組的生理因素之一。

回顧氯胺酮與七氟醚組對(duì)小鼠造成的學(xué)習(xí)與記憶能力損傷，其涉及的信號(hào)終點(diǎn)主要是Caspase-3凋亡途徑激活以造成的海馬神經(jīng)元凋亡[25]。Bax與Bcl-2分別是促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白，協(xié)同調(diào)控線粒體外膜的透化。在七氟醚或氯胺酮誘導(dǎo)過(guò)程中，Bax表達(dá)增加而B(niǎo)cl-2表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致線粒體外膜破壞，釋放細(xì)胞色素C，促進(jìn)Apaf-1的寡聚化，致使下游Caspase-3的凋亡途徑的激活[26]。然而，氯胺酮與七氟醚介導(dǎo)的學(xué)習(xí)與記憶損傷的差異性，可能是由NMDA-NO信號(hào)通路介導(dǎo)的。NMDA受體廣泛表達(dá)于海馬神經(jīng)突觸后膜，氯胺酮是NMDA特異性拮抗劑[27]。NMDA受體組成亞基中NMDAR2B是一種被認(rèn)可的“聰明基團(tuán)”，針對(duì)此基團(tuán)已有設(shè)計(jì)并上市了用于抑郁治療的藥物[28-29]。無(wú)論是抑郁癥研究，還是POCD的研究中，都有顯示較低劑量的氯胺酮被發(fā)現(xiàn)是通過(guò)減少NMDA受體蛋白的表達(dá)，抑制下游炎性細(xì)胞因子，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究中使用的氯胺酮介導(dǎo)的Caspase-3凋亡途徑激活的效應(yīng)高于NMDA信號(hào)通路的抗炎作用，最終導(dǎo)致了老齡小鼠突觸損傷、Aβ沉積增加。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，與七氟醚組相比，氯胺酮組NMDA表達(dá)減少，且Bcl-2表達(dá)增加，因此對(duì)于細(xì)胞凋亡認(rèn)知功能的影響較小。

4 結(jié)論

七氟醚與氯胺酮都會(huì)造成老齡小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶能力損傷。其生理機(jī)制涉及Caspase-3信號(hào)通路的激活造成神經(jīng)元樹(shù)突棘損傷與Aβ沉積，然而氯胺酮基于NMDA信號(hào)的抑制，可能在一定程度上減輕了小鼠認(rèn)知功能的損傷。因此，在臨床上應(yīng)用中，氯胺酮誘導(dǎo)患者出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷的幾率較低，在可能造成患者認(rèn)知功能損傷的手術(shù)中應(yīng)將氯胺酮使用的優(yōu)先級(jí)提高。