羅娜 孫蔚林 寧靜 李衛(wèi)平

(解放軍總醫(yī)院海南分院婦產科，海南 三亞 572013)

盆腔炎(Plvic inflammatory disease，PID)[1]是指累及女性盆腔內生殖器官及其周圍結締組織、盆腔腹膜的炎癥性疾病。PID反復發(fā)作或遷延不愈，會導致患者出現疼痛不適、異位妊娠、不孕以及影響性生活等，對婦女的身心健康和生活造成嚴重影響。目前針對PID的內科治療手段主要是運用抗生素消除/緩解炎癥，以及物理療法來活血化瘀，緩解疼痛不適，促進炎癥消退。但是仍存在長期效果欠佳，復發(fā)率高的缺點[2-3]。骨髓間充質干細胞[4](Bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs) 是一類具有自我更新能力的非造血干細胞。以往的研究表明[5-6]，BMSCs有可能分化為間充質或非間充質細胞系，且具有向損傷部位遷移的能力，通過調節(jié)先天性和獲得性免疫細胞的增殖和功能，促進傷口愈合和組織再生，抗炎和抑制免疫反應。Exosomes是一類由細胞主動分泌的，直徑在30 nm～150 nm的囊泡樣小體[7]。在正常和病理條件下，Exosomes通過穿梭蛋白質、mRNA和microRNAs介導細胞間的通訊有助于遺傳和生化信息在細胞間的傳遞。在腫瘤發(fā)生、炎癥免疫反應等多個生理病理過程中發(fā)揮重要的調控作用。有研究顯示[8-9]，BMSCs能夠分泌豐富的Exosomes，在BMSCs與靶細胞之間交換蛋白質和遺傳信息，發(fā)揮重要的介導作用。本研究通過構建大鼠PID模型，并觀察BMSCs源性Exosomes對PID模型大鼠氧化應激和炎癥反應的影響，為臨床上治療PID提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級雌性SD健康大鼠60只，質量180～220 g，購于解放軍總醫(yī)院醫(yī)學實驗動物中心；左氧氟沙星片(可樂必妥)購于第一三共制藥(北京)有限公司；DMEM F12培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；ExoQuiekTC外泌體提取試劑盒購自美國SBI公司；TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6 和IL-10 ELISA 試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；大鼠SOD、MDA和T-AOC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所； Centrifuge5424離心機購自Eppendorf公司；1-15K高速冷凍臺式離心機購自Sigma公司；CyFlow? Counter流式細胞儀購自德國Partec公司；MCO-15AC型CO2孵育箱購自日本SANYO公司；LH 750全自動血細胞分析儀購自美國貝克曼庫爾特；DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；IX-70型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；MultiImageTM凝膠成相系統(tǒng)購自Alpha Innotech公司；NanoDrop 1000超微量分光光度計購自美國Nanodrop公司。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定 ①BMSCs分離和培養(yǎng)：采用貼壁法培養(yǎng)BMSCs、3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉實驗SD大鼠，頸部脫臼處死大鼠， 75%乙醇浸泡10 min進行消毒。無菌條件下截取實驗SD大鼠的股骨和脛骨的骨骺末端，PBS溶液反復沖洗骨骺末端的骨髓腔，收集沖洗后PBS溶液。移液器反復吹打，篩網過濾，制作成單細胞懸液，以1500 r/min條件下離心10 min，棄去上清液。將細胞的密度調整為(1～3)×106/mL，接種至含LG-DMEM完全培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中。在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，去除掉非貼壁細胞。然后加入等量LG-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)純化細胞，每3天更換一次LG-DMEM培養(yǎng)液。待細胞長至80%左右融合時，0.25%胰蛋白酶，以1:3的比例傳代。取第3代生長良好的細胞進行實驗研究。②BMSCs的鑒定：0.25%胰蛋白酶消化BMSCs，制作成細胞密度為1×106/ml的單細胞懸液。分別加入熒光直標的CD44和CD90單克隆抗體。混和均勻后，黑暗條件下孵育30 min，用PBS溶液洗滌3次，并為每組樣品設立單獨的陰性對照。采用流式細胞儀進行檢測表面標志物；成脂和成骨誘導分化檢測其分化能力。

1.2.2 BMSCs源性Exosomes的提取和鑒定 BMSCs培養(yǎng)待細胞融合度達到90%后，更換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)基上清液。4℃的條件下以300 g×10 min，2000 g×20 min離心去除細胞和細胞碎片形成的沉淀。離心后取上清液置于新的EP管，每500 μL上清液加入ExoQuiekTC試劑50 μL；顛倒EP管約20次混合，置于4℃冰箱靜置約12 h。然后在4℃、3000 g條件下離心30 min，去除上清液，保留沉淀。使用移液槍取400 μL 1×PBS并反復均勻吹打離心沉淀物，該重懸液中富含Exosomes顆粒，將重懸液轉移至新的1.5 mL EP中。透射電子顯微鏡觀察提取的Exosomes形態(tài)。Western blot 檢測Exosomes標志物表達。

1.2.3 PID大鼠動物模型建立及分組 所有實驗大鼠在術前12 h開始禁止進食，自由飲水，手術區(qū)域剃毛備皮。稱重大鼠后，3%戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔內注射麻醉。待麻醉起效后，橡皮筋固定大鼠于操作臺上。下腹部備皮常規(guī)消毒，取腹正中切口1.5～2 cm，開腹后暴露子宮。采用l mL注射器針頭進針入子宮腔內反復來回抽拉以造成子宮內膜組織機械損傷。向輸卵管卵巢方向緩慢注射0.1 mL濃度為3×1012/L的混合細菌懸液(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌三者比例為2:1:1混勻)。隨手逐層縫合關腹，碘伏消毒術區(qū)。假手術組手術操作步驟僅為開腹和關腹，未對子宮腔進行機械損傷以及注射混合細菌懸液。將40只PID模型大鼠采用隨機數字表法分為：模型組(單純構建PID模型大鼠未給與任何特殊處理)；治療組(構建PID模型大鼠術后第3天開始腹腔注射100 μg/mL的Exosomes稀釋液1 mL，連續(xù)注射3天)；左氧氟沙星組(構建PID模型大鼠第3天開始60 mg/kg/天左氧氟沙星灌胃給藥，連續(xù)3天)；對照組(構建PID模型大鼠后腹腔注射相應劑量生理鹽水)。另外設置空白組(正常飼養(yǎng)大鼠，不給予任何處理)和假手術組。每組10只。

1.2.4 子宮組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE )染色 取實驗大鼠子宮組織用10%多聚甲醛溶液固定24 h，然后經梯度脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片(厚5 μm)，HE染色后制作成病理切片。顯微鏡下觀察子宮組織病理學改變情況。

1.2.5 外周血白細胞測定 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉實驗大鼠，開腹用10 mL注射器抽取下腔靜脈血約2 mL，采用全自動血細胞分析儀測定靜脈血中白細胞數量、種類、比例等。

1.2.6 血清樣本采集 3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉實驗大鼠，開腹用10 mL注射器抽取下腔靜脈血約8 mL置入微量離心管。室溫下靜置1 h，然后2000 rpm離心20 min，取上清置于新1.5 mL微量離心管。

1.2.7 血清炎癥因子檢測 采用ELISA 試劑盒分別檢測大鼠血清中炎癥介質TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6 和IL-8的濃度水平。所有檢測均嚴格按照檢測試劑盒說明書步驟進行操作。

1.2.8 氧化應激狀態(tài)評估 ①丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測：采用南京建成生物工程研究所的MDA檢測試劑盒，實驗按照試劑盒使用說明步驟進行操作。②超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性檢測：采用南京建成生物工程研究所的SOD檢測試劑盒，實驗按照試劑盒說明書步驟進行操作。③總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)檢測：采用北京索萊寶科技有限公司的T-AOC檢測試劑盒，實驗按照試劑盒說明書步驟進行操作。

2 結果

2.1 BMSCs的鑒定 光學顯微鏡下觀察，通過貼壁法獲取并的培養(yǎng)BMSCs細胞形態(tài)呈多邊形或不規(guī)則的梭形粘附生長，兩端具有長突起，細胞核呈圓形或橢圓形，見圖1A；流式細胞儀檢測結果顯示， BMSCs的重要標志物CD44和CD90的表達陽性率均大于90%，見圖1B。

圖1 大鼠BMSCs鑒定Figure 1 Identification of BMSCs in rats

2.2 BMSCs源性Exosomes的鑒定 透射電鏡下觀察，提取到的Exosomes形態(tài)呈圓形或橢圓形，直徑在40～100 nm，具有較為完整包膜的小囊泡，見圖2A。Western blot檢測顯示其表達Exosomes特異性蛋白CD63和CD9，見圖2B。

圖2 BMSCs源性Exosomes的鑒定Figure 2 Identification of exosomes derived from BMSCs

2.3 大鼠子宮HE染色 空白組和假手術組大鼠子宮結構正常，細胞排列規(guī)則，未見紅細胞和炎細胞浸潤。模型組和對照組大鼠子宮結構紊亂，細胞排列不規(guī)則，腺體出現擴張或結構不清晰，可見紅細胞和炎細胞浸潤。治療組和左氧氟沙星組大鼠子宮結構基本正常，細胞排列較規(guī)則，少許紅細胞和炎細胞浸潤，見圖3。

圖3 子宮組織HE染色(200×)Figure 3 HE staining of uterine tissue

2.4 大鼠外周血白細胞檢測結果 模型組大鼠外周血白細胞數、中心粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞較空白組均明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠外周血白細胞數、中心粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞均較模型組出現降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療組大鼠除中心粒細胞數要高于左氧氟沙星組(P<0.05)，其余外周血白細胞檢測指標相比差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠外周血白細胞檢測結果Table 1 Detection results of peripheral blood leukocytes in rats of each group

2.5 大鼠血清炎癥因子檢測結果 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8的濃度水平值均較空白組明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10的濃度水平值均較模型組出現降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組大鼠除血清IL-1β濃度水平值高于左氧氟沙星組(P<0.05)，其余炎癥因子血清濃度水平值相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子檢測結果比較Table 2 Comparison of serum inflammatory factors in each group

2.6 大鼠氧化應激狀態(tài)評估結果 模型組大鼠SOD和T-AOC數值均較空白組明顯降低，而MDA數值則明顯升高(P<0.05)。治療組大鼠SOD和T-AOC數值均較模型組出現升高，而MDA數值則出現降低，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同左氧氟沙星組相比，治療組大鼠SOD、T-AOC和 MDA數值比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠氧化應激檢測結果比較Table 3 Comparison of the test results of oxidative stress in rats of each group

3 討論

BMSCs是具有多向分化潛能和自我更新能力的多能干細胞。在合適的條件下，BMSCs可以被誘導分化為多種組織細胞。與其他干細胞不同，BMSCs在基因上更穩(wěn)定，在體外環(huán)境下存活時間更長，且BMSCs還具有免疫調節(jié)作用。因而BMSCs成為多種疾病干細胞治療的理想選擇，具有廣闊的臨床應用前景[10]。BMSCs發(fā)揮治療效應的機制非常復雜，目前已知的是，其除了能夠移植到受損器官上并進行分化來發(fā)揮其治療作用，還可能通過以下方式來發(fā)揮其生物學作用[11-12]：①分泌可溶性因子(細胞因子、生長因子、激素)的旁分泌活性。②細胞與細胞相互作用，在細胞之間形成納米管隧道。③分泌含有蛋白質和RNA的囊泡。Exosomes是大多數原核和真核細胞(包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等)釋放的納米級微泡(直徑30～100 nm)，將其功能效應物(如mRNAs、miRNAs和蛋白質) 轉移到受體細胞以調節(jié)生理和病理過程。Exosomes是傳遞膜封閉信號分子和基因產物的關鍵載體，直接參與細胞間的信號傳遞，是機體旁分泌的重要組成部分[13]。BMSCs來源的Exosomes具有抗凋亡、免疫調節(jié)、抗炎和促血管生成的特性。Jun等[14]研究發(fā)現，BMSC源性Exosomes能增強自噬相關蛋白LC3IIB和Beclin-1的表達，促進自噬體的形成，進而抑制脊髓損傷大鼠神經細胞凋亡，促進其功能行為恢復。Jiang等[15]通過體外研究發(fā)現，BMSC源性Exosomes通過抑制TGF-TGF/Smad信號通路，能夠有效促進皮膚創(chuàng)面愈合。因此，Exosomes可能是BMSCs發(fā)揮其生物學效能的重要工具和途徑。

PID的發(fā)病機制主要是由于免疫因素影響下病原體入侵感染，導致機體炎性介質和自由基的異常分泌活化，進而產生一系列病理生理改變。根據美國疾病控制和預防中心的指導方針[16]，臨床使用抗生素是PID治療的首選。然而，大多數患者經過長期治療后往往發(fā)生細菌耐藥性。因此，開發(fā)具有良好療效、低副作用的天然藥物對預防PID具有重要意義。氧化應激和炎癥反應是PID的最主要的病理生理機制[17]。PID的發(fā)病過程中，機體活性氧(ROS)的過度產生導致氧化與抗氧化失衡而引起氧化應激狀態(tài)，最終導致組織細胞損傷。氧化應激與炎癥反應相輔相成，炎癥是白細胞對挑戰(zhàn)組織內穩(wěn)態(tài)的因素(包括氧化應激引起的因素)的反應，過度的炎癥反應會損傷組織細胞，導致大量氧自由基產生及NO的合成釋放下降[18]。ROS也被證實是多個炎癥信號通路的啟動者和調節(jié)者，通過激活Nrf2、NF-κB、ASK1、AP-1、補體等炎癥信號通路，進而增強炎癥應答[19-20]。因此，有效對抗氧化應激，改善炎癥反應已成為PID治療領域的研究重點。

BMSCs來源的Exosomes在對抗氧化應激和炎癥反應方面具有良好的生物學特性。Campbell等[21]研究發(fā)現在氧化應激損傷后，BMSCs源性的Exosomes能顯著降低了心臟干細胞(Cardiac stem cells，CSCs)的凋亡率和ROS的產生。Zheng等[22]通過研究類風濕關節(jié)炎模型大鼠后發(fā)現，BMSCs源性的Exosomes通過傳遞上調miR-192-5p的表達來抑制類風濕關節(jié)炎的炎癥反應。因此，本次實驗采用BMSCs來源的Exosomes來對PID模型大鼠進行干預研究。我們采用全骨髓貼壁篩選培養(yǎng)法分離和純化大鼠骨髓組織中的 BMSCs，通過顯微鏡觀察和干細胞表型分析獲得的細胞是BMSCs。然后通過ExoQuick-TC法從大鼠BMSCs培養(yǎng)基上清中分離Exosomes。通過透射電鏡觀察其形態(tài)以及Western blot檢測其表達的外泌體特異性分子標記，證實了為BMSCs源性Exosomes。隨后我們經腹腔注射BMSCs源性Exosomes進行干預。HE染色結果顯示，治療組大鼠子宮組織充血和炎癥細胞浸潤等病理變化與左氧氟沙星組大鼠相近，而較未經任何干預的模型組有明顯改善。這一研究結果提示BMSCs源性Exosomes對于PID模型大鼠具有較好的治療作用，能夠改善子宮充血水腫和炎癥反應。

TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的檢測可作為臨床上判斷炎癥反應嚴重程度的生物學指標[23-24]。本研究中，PID模型大鼠存在明顯全身性炎癥反應，而子宮是PID過程中最容易受累的靶器官，因而也會導致子宮發(fā)生比較明顯的炎癥反應。而治療組大鼠外周血炎癥細胞數量較未經任何干預的模型組出現降低，且血清中相關炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8的表達也發(fā)生明顯降低。由于左氧氟沙星為廣譜抗生素，是目前治療PID的常用藥，具有良好的抗感染炎癥效能。同左氧氟沙星組相比，治療組大鼠除中心粒細胞數和血清IL-1β濃度水平值要高于左氧氟沙星組，其余外周血白細胞和血清炎癥因子比較無統(tǒng)計學差異。這表明BMSCs源性Exosomes能有效減輕PID模型大鼠的全身性炎癥反應。氧化應激方面，SOD是清除氧自由基和抑制組織損傷的重要抗氧化酶，MDA是脂質過氧化的最終產物，T-AOC代表抗氧化物質和抗氧化酶等構成總抗氧化水平，這三者反映機體清除氧自由基的能力和氧自由基對細胞的損傷程度，是反映機體對抗氧化應激損傷能力的生物學指標[25-26]。本研究中，PID大鼠SOD和T-AOC數值均較空白組明顯降低，而MDA數值則明顯升高，表明PID模型大鼠存在明顯的氧化應激。而經治療組大鼠SOD和T-AOC數值均較模型組升高， MDA數值則降低。提示BMSCs源性Exosomes能夠增強PID大鼠體內的抗氧化能力，抑制ROS的過度產生，進而降低機體的氧化應激水平。

4 結論

本研究結果顯示，BMSCs源性Exosomes對PID模型大鼠具有較好的治療作用，其效能可能在于Exosomes能通過細胞間傳遞效應物質來抑制氧化應激反應和炎癥反應。然而，目前關于BMSCs源性Exosomes療效的證據是多種多樣的，其具體作用機制尚待明確，隨著對Exosomes功能和作用機制的不斷研究深入，將為臨床治療PID提供新的策略。