劉海龍 李娟 董小鑫 黃翠蘭

(1.西安交通大學， 陜西 西安 710000；2.岳池縣人民醫(yī)院， 四川 廣安 638300；3.西安交通大學醫(yī)學院附屬西安市第九醫(yī)院， 陜西 西安 710000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其中原發(fā)性上皮性卵巢癌較為多見，占所有卵巢癌的90%左右[1]。早期卵巢癌患者無明顯癥狀，多數(shù)患者就診時已處于晚期，易錯過最佳治療時期，影響患者預后[2]。所以早期診斷卵巢癌，進一步評估病情進展，進而采取相應治療措施是提高診療成功率的關鍵[3]。c-Met(c-metprotoncogene)是原癌基因，具有酪氨酸激酶活性，參與細胞信號轉導、調控細胞骨架重建，已證實其表達水平與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)作為一種多效性肽類激素，可通過與靶細胞中親和力較高的TrkA受體及低親和力P75受體結合調控細胞正常生理活動，且NGF在多種惡性腫瘤中呈異常表達狀態(tài)，與腫瘤進展、預后密切相關[5]。研究顯示，c-Met和Trk受體除了在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中各自的作用外，在促進腫瘤進展方面也有關系[6]?；罨腸-Met增強TrkA信號傳導和神經(jīng)生長因子的生物活性[7]，TrkB上調腫瘤細胞中c-Met的表達，增強腫瘤細胞的侵襲力[8]。TrkA和c-Met的高表達和c-Met拷貝數(shù)增加/擴增是涎腺導管癌(Salivary duct carcinoma，SDC)中的常見事件，并且TrkA和c-Met的高表達揭示了在HER2陰性的SDC中與不良預后相關的趨勢[9]。最近的分子研究表明，膠質母細胞瘤中的c-Met和Trk通路相互反式激活[10]。本研究用NGF、TrkA、c-Met的表達情況對原發(fā)性上皮性卵巢癌患者進行病情評估，并分析其在該病患者預后預測中的作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析岳池縣人民醫(yī)院2016年6月～2018年6月收治的115例原發(fā)性上皮卵巢癌患者，年齡36～75歲，平均(50.31±6.65)歲。將卵巢癌患者作為癌組織組，將對側正常卵巢組織作為正常組織組，每組各115例。納入標準：①所有患者均經(jīng)病理檢查證實。②未接受化療、放療、免疫等輔助治療。③本研究患者臨床資料均完整。④無其它惡性疾病。⑤受試者簽署知情同意書。排除標準：①合并肝、腎、心臟臟器嚴重疾病者。②合并嚴重神經(jīng)功能、認知功能障礙者。③依從性差者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究方法 收集所有患者臨床資料，比較NGF、TrkA及c-Met在癌組織組及正常組織組的表達情況；分析NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮性卵巢癌患者各病理參數(shù)的相關性，記錄所有患者在隨訪時間內存活及死亡情況，采用多元Logistic回歸分析影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的危險因素；采用ROC曲線分析NGF、TrkA及c-Met對原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存預后的預測價值。

1.3 標本采集及檢測方法 NGF、TrkA及c-Met：采用免疫組化法進行檢測，NGF、TrkA單克隆抗體購于美國ABCAM公司，c-Met購于北京博奧森生物技術有限公司。免疫組化采用鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化酶連接法(Streptavidin-perosidase，SP)法，SP試劑盒購自北京中山生物科技有限公司。各步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行操作[11]。染色結果判定標準[12]：以細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為NGF、TrkA及c-Met陽性染色細胞。每張切片隨機選取10個高倍視野，按照陽性細胞的染色數(shù)量和顯色強度分級評分，取其平均值。細胞染色數(shù)量的評分按照陽性細胞計數(shù)占同類細胞的百分比，計算該病例的細胞陽性率。陽性細胞數(shù)<5%計0分；6%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；>76%計4分。根據(jù)細胞染色強度加以評分，無著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。染色強度和陽性范圍得分相加，≥2分為陽性，其余為陰性。

1.4 隨訪方法 本研究隨訪從患者治療開始，直至本研究結束，為期2年，截止于2020年6月；平均隨訪時間為(15.71±5.93)個月。對患者隨訪的方式主要采用電話隨訪、微信隨訪及患者來院復查為主。

2 結果

2.1 兩組NGF、TrkA及c-Met的表達情況比較 癌組織組NGF、TrkA及c-Met陽性表達率顯著高于正常組織組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌的表達(500×)Figure 1 Expression of NGF，TrkA and c-Met in primary epithelial ovarian cancer注：A. NGF在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達；B. NGF在正常卵巢癌組織表達；C. TrkA在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達；D. TrkA在正常卵巢癌組織表達；E. c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌組織表達；F. c-Met在正常卵巢癌組織表達

2.2 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌患者的表達與臨床病理特征 原發(fā)性上皮卵巢癌患者NGF、TrkA及c-Met表達與年齡、組織分化類型、腹腔積液無明顯相關性(P>0.05)。而與淋巴結轉移、臨床分期、分化程度有相關性(P<0.05)。見表2。

表2 NGF、TrkA及c-Met在原發(fā)性上皮卵巢癌患者的表達與臨床病理特征[n，n(×10-2)]Table 2 Expression of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer and their relationship with clinicopathological features

2.3 原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后情況 經(jīng)兩年隨訪后顯示，患者兩年生存率為35.65%(41/115)。NGF表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為(32.75±1.82)個月、(20.35±1.01)個月；TrkA表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為(30.09±1.08)個月、(21.46±2.15)個月；c-Met表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為(32.27±2.08)個月、(18.93±1.04)個月。生存分析顯示NGF、TrkA及c-Met表達陰性者生存期較長(P<0.05)。見圖2～4。

圖2 NGF表達與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時間曲線圖Figure 2 NGF expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

圖3 TrkA表達與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時間曲線圖Figure 3 The relationship between TrkA expression and survival time of patients with primary epithelial ovarian cancer

圖4 c-Met表達與原發(fā)性上皮卵巢癌患者生存時間曲線圖Figure 4 4 c-met expression and survival time curve of patients with primary epithelial ovarian cancer

2.4 影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的單因素和多因素分析 分化程度、臨床分期、淋巴轉移、NGF、TrkA及c-Met陽性是影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with primary epithelial ovarian cancer

2.5 NGF、TrkA及c-Met對原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的預測價值 采用ROC曲線分析 NGF、TrkA、c-Met及三者聯(lián)合對原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的預測價值，NGF、TrkA、c-Met及三者聯(lián)合曲線下面積分別為0.780、0.851、0.808、0.946，各指標曲線下面積以聯(lián)合檢測最大，故聯(lián)合檢測的預測價值最佳，見表4、圖5。

表4 NGF、TrkA及c-Met對原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的預測價值Table 4 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

圖5 NGF、TrkA及c-Met對原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的預測價值Figure 5 Prognostic value of NGF，TrkA and c-Met in patients with primary epithelial ovarian cancer

3 討論

近年來，由于原發(fā)性上皮卵巢癌早期缺乏特異性癥狀，臨床病死率較高，患者生存預后總體較差，因此，如何提高早期原發(fā)性上皮卵巢癌篩查準確率越來越受重視[13-14]。

c-Met位于染色體7q21-31，由α及β鏈構成異二聚體，與HGF特異性結合誘導c-Met蛋白構想改變，催化底物蛋白，將信號向細胞核內傳導，參與細胞新型轉導及調控細胞骨架，使細胞黏附作用減弱，誘導新生血管生成，增強細胞外基質、金屬蛋白酶表達水平，刺激惡性腫瘤細胞生長及轉移[15-16]。相關研究發(fā)現(xiàn)，c-Met可增強腫瘤細胞基因型，使高表達水平腫瘤細胞與HGF結合，使腫瘤細胞敏感性及侵襲性增加[17-18]。目前，已有研究證實c-Met的過表達和基因擴增與肝癌、非小細胞癌、乳腺癌、食管癌等惡性腫瘤發(fā)生及轉移密切相關[19-20]。相關學者采用定量PCR和免疫組織方法檢測結腸癌組織及正常結腸組織c-Met表達的研究顯示，c-Met在腸癌中的表達遠遠高于正常結腸粘膜[21]。本研究結果顯示，在原發(fā)性上皮卵巢癌中c-Met陽性表達率顯著高于正常組織，且隨著臨床分期增高、組織分化程度的增加及淋巴結的轉移，c-Met陽性的高表達率也顯著上升，與既往研究一致?？紤]c-Met參與信號通路，可激活酪氨酸激酶，級聯(lián)激活 P13K/Akt、Wnt/β-catenin以及MAPK信號多條信號通路，調節(jié)卵巢癌組織細胞的增殖、分化和侵襲[22-23]。

NGF是神經(jīng)生長因子家族一員，通過與靶細胞表面的神經(jīng)生長因子受體特異性結合介導發(fā)生生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，NGF不僅是神經(jīng)及非神經(jīng)細胞生長、分化、增殖等所需中重要物質；還可以通過旁分泌、自分泌作用促進肝細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤細胞增殖、血管新生及浸潤[24-26]。此外，相關國外研究發(fā)現(xiàn)，NGF可調節(jié)垂體卵泡刺激素的分泌及卵巢上皮表面FSH受體水平變化[27]。TrkA作為NGF受體之一，具有內在酪氨酸激酶活性，是NGF的功能性受體。研究表示，TrkA與NGF高親和力結合，使解離速度變慢，促使TrkA結構發(fā)生磷酸化，激活相應生物學作用[28]。目前，相關眾多研究表明TrkA在非神經(jīng)來源的腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用。Raychaudhuri等[29]在Hodgkin淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，TrkA表達水平明顯高于正常細胞，且使用酪氨酸阻滯劑處理后，可減少腫瘤細胞的存活率. 預示TrkA在將來可能是一種新型的腫瘤治療方法。此外，也有研究提出TrkA活化在晚期漿液性卵巢腫瘤中常見，TrkA的表達水平與晚期漿液性卵巢腫瘤細胞呈正相關。類似的，相關研究予以應用阻斷TrkA作用的酪氨酸寂寞受體阻斷劑隔絕TrkA作用后發(fā)現(xiàn)，其對腫瘤細胞的生成可明顯減少，且可誘導腫瘤細胞凋亡，考慮TrkA在分子靶向治療中具有廣闊應用前景[30-31]。而本研究顯示，NGF、TrkA陽性與原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存密切相關，說明NGF、TrkA表達水平對臨床治療及預后預測具有重要指導意義。此外，本研究為深入了解NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存的預測價值，采用ROC曲線研究顯示，NGF、TrkA及c-Met水平聯(lián)合對原發(fā)性上皮卵巢癌患者預后生存預測價值最佳，說明檢測NGF、TrkA及c-Met水平可作為預測患者預后的有效手段。

4 結論

綜上所述，NGF、TrkA及c-Met與原發(fā)性上皮卵巢癌患者病情評估、預后預測密切相關，臨床監(jiān)測其水平對患者診斷治療及預后預測具有重要作用，臨床可根據(jù)該水平變化制定個體化治療方案，以延長患者的生存期。本研究為單中心、回顧性研究，臨床資料收集不全，使得研究受到一定的限制，后期將進一步擴大樣本量或多中心合作研究予以進一步證實。