渠亞超 殷繼明 任鋒 櫻川宣男 加茂功 鮑旭麗 陳德喜 李寧 樸正福

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100069；2.北京市肝病研究所，北京 100069；3.日本北里大學(xué)再生醫(yī)療部門，東京 108-8641)

人羊膜位于胎盤的最內(nèi)層，為厚度20～500 μm的半透明膜[1-2]，擁有優(yōu)越的細(xì)胞外基質(zhì)成分，被認(rèn)為是天然支架中最好的材料而廣泛運(yùn)用于組織工程學(xué)中[3-4]。人羊膜作為細(xì)胞載體的支架材料具有很多優(yōu)點(diǎn)，如細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)培養(yǎng)、生物相容性好、可吸收性和無毒性反應(yīng)等[5]，已被廣泛應(yīng)用于各部位損傷修復(fù)，如角膜移植、皮膚缺損、軟骨損傷后的修復(fù)及外周神經(jīng)再生等領(lǐng)域，并獲得良好的治療效果[6-13]。脫細(xì)胞人羊膜支架是用物理、化學(xué)、以及酶消化來破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞之間的化學(xué)鍵，釋放出細(xì)胞內(nèi)容物，以制成具有活性物質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)生物材料。脫細(xì)胞人羊膜支架具有生物相容性好、低免疫原性等特點(diǎn)，富含多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)因子、膠原蛋白等為細(xì)胞生長提供適宜微環(huán)境[14]。羊膜細(xì)胞外基質(zhì)作為一種生物材料在組織工程中的應(yīng)用越來越受到重視。羊膜干細(xì)胞具有強(qiáng)大的更新和分化能力，李文武等[15]證實(shí)干細(xì)胞移植用于肝衰竭中能提高肝功能水平、減輕肝臟局部炎癥細(xì)胞聚集，從而緩解肝臟組織病理損傷。Shi 等[16]評(píng)估了干細(xì)胞治療HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭患者的安全性和有效性，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞靜脈輸注后可增加患者血清白蛋白和膽堿酯酶水平、凝血酶原活性以及血小板計(jì)數(shù)，同時(shí)顯著降低血清總膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶水平，改善肝功能，減少終末期肝病模型評(píng)分，從而提高患者生存率。本研究從胎盤中分離完整的羊膜，用物理化學(xué)方法去除細(xì)胞成分制備成細(xì)胞外基質(zhì)液，并用不同濃度包被培養(yǎng)皿，在其上培養(yǎng)羊膜源性干細(xì)胞，并對(duì)脫細(xì)胞人羊膜支架對(duì)羊膜來源干細(xì)胞的生長增殖作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 羊膜源性干細(xì)胞(hAMC-SP)分選及分離培養(yǎng)：取38～40周孕婦剖宮產(chǎn)術(shù)后羊膜，獲取胎盤事先得到知情同意。羊膜以0.125%胰酶(含1.3 mM EDTA)37oC 下消化后清除人羊膜上皮細(xì)胞(human amnion epithelial cells，hAECs)。以0.01%膠原酶及DNA酶混合液37oC繼續(xù)消化1 h，同時(shí)置振蕩器振蕩。離心后獲得的細(xì)胞即 hAMCs。準(zhǔn)備2份hAMCs(106/mL)懸浮于DMEM(含2% FBS、10 mM HEPES)中，用5 μg/mL Hoechst 33342 (Sigma)進(jìn)行細(xì)胞核染色120 min。為遮斷染料排除泵，其中1份加50 μM verapamil(維拉帕米)，作為對(duì)照。染色結(jié)束后4℃下離心(1500 rpm，5 min)。Hanks′平衡鹽溶液(含2% FBS、10 mM HEPES)重懸細(xì)胞至(2～4)×106/mL，然后加入2 μg/mL PI(Sigma)。裝備360 nm紫外激光器的EPICS ALTRA流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)用于細(xì)胞篩選。Hoechst 33342及PI首先受紫外激發(fā)。其熒光發(fā)射分別利用450/20 nm 帶通濾光片(Hoechst藍(lán)色熒光信號(hào))和675 nm 長帶濾光片(Hoechst紅色熒光信號(hào))進(jìn)行檢測(cè)。從死細(xì)胞發(fā)射出的PI熒光信號(hào)用帶通濾光片進(jìn)行測(cè)定。610 nm短通型二色分光鏡用于分離這些反射波長。Hoechst的藍(lán)、紅色熒光以線性標(biāo)度顯示。在這條線上顯示Hoechst熒光的為SP側(cè)群細(xì)胞，加verapamil的對(duì)照組在此區(qū)域顯示弱或消失Hoechst熒光。SP區(qū)域分選出的hAMC-SP細(xì)胞，用DMEM/F-12 (1:1) 培養(yǎng)皿(含10% FBS，10 ng/mL人白細(xì)胞抑制因子(LIF，CHEMICON)、10 ng/mL表皮生長因子(PeproTech)、10 ng/mL β成纖維成長因子(bFGF，Pepro Tech)、0.2 mM 2-巰基乙醇(Sigma)和脫細(xì)胞羊膜支架包被的培養(yǎng)皿，置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。羊膜液制備：得到患者的知情同意前提下，獲得38～40周孕婦剖宮產(chǎn)術(shù)后的羊膜。用PBS反復(fù)清洗后把羊膜切成1～2 cm，加入0.02% EDTA溶液后反復(fù)震搖。離心后棄上清液，加入0.25 M醋酸溶液后在90℃水中緩慢搖動(dòng)，直至完全溶解。經(jīng)過多次離心后，上清放入至透析袋，并在水中進(jìn)行反復(fù)透析。蛋白定量后低溫保存。脫細(xì)胞人羊膜支架包被培養(yǎng)皿制備：選擇96孔板，在里面鋪平羊膜液，以0.5～1.5 mg蛋白量/cm2面積鋪培養(yǎng)板(根據(jù)280/260 OD值決定)。根據(jù)羊膜液濃度不同設(shè)置低濃度組、中濃度組及高濃度組。包被培養(yǎng)皿進(jìn)行紫外線照射(離培養(yǎng)皿15 cm，15 w UV強(qiáng)度照射15 min)，并保存在冷藏環(huán)境下(保存時(shí)間不超過一年)。用類似的方法制備0.9%生理鹽水包被培養(yǎng)皿作為對(duì)照組、人細(xì)胞外基質(zhì)(HEM)(BD Biosciences，USA)培養(yǎng)皿及膠原蛋白I(足鍵，Iwaki，Japan)培養(yǎng)皿。蛋白質(zhì)濃度利用Quick Start Bradford Dye Reagent (Bio Rad，USA)檢測(cè)。

1.2 羊膜干細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 羊膜源性干細(xì)胞(hAMC-SP)3500～4500個(gè)/cm2鋪平24孔培養(yǎng)皿，對(duì)照組及每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)平行孔(n=3)，且做了3次重復(fù)同樣實(shí)驗(yàn)。置于37℃、5% CO2，飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。不同的時(shí)間用EDTA-胰酶溶液進(jìn)行消化，并PBS洗滌后用于測(cè)定。羊膜干細(xì)胞增殖活性用CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (Dojindo，Japan)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩樣本間比較采用校正t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAMC-SP培養(yǎng)情況 羊膜干細(xì)胞在脫細(xì)胞人羊膜支架包被培養(yǎng)皿上在37℃，5% CO2下進(jìn)行培養(yǎng)2～3天后細(xì)胞粘附在培養(yǎng)皿底面，更換培養(yǎng)液，以清除未貼壁細(xì)胞。顯微鏡下觀察其生長情況，每3天換液，細(xì)胞長滿后用膠原酶-EDTA消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 hAMC-SP大部分1～3天內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈現(xiàn)梭性或星性，此時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)單個(gè)分散或幾個(gè)細(xì)胞克隆。培養(yǎng)一周后細(xì)胞增殖速度明顯，發(fā)生形態(tài)變化，呈寬大扁平，細(xì)胞成群。免疫細(xì)胞化學(xué)分析，hAMC-SP細(xì)胞表達(dá)Vimentin、Nestin、Musashi-1等神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白，也表達(dá)Flt-1、Integrin β及HNF等肝干細(xì)胞分化相關(guān)蛋白[17]。在脫細(xì)胞人羊膜支架材料包被培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的細(xì)胞與其他包被生物材料相比，粘附快、排列整齊均勻、未貼壁細(xì)胞很少、增殖速度明顯加快，見圖1。

圖1 羊膜干細(xì)胞在脫細(xì)胞人羊膜支架材料包被培養(yǎng)皿上生長情況(100×) Figure 1 Growth of amniotic membrane stem cells on a culture dish coated with acellular amniotic membrane scaffold

2.2 hAMC-SP在脫細(xì)胞人羊膜支架包被培養(yǎng)皿上培養(yǎng)情況 不同濃度(低濃度0.5 mg/cm2、中濃度1.0 mg/cm2、高濃度1.5 mg/cm2)的脫細(xì)胞人羊膜支架包被培養(yǎng)皿上hAMC-SP的生長增殖速度顯示不一樣，包被濃度越高細(xì)胞生長速度越快，提示脫細(xì)胞人羊膜支架材料對(duì)羊膜源性干細(xì)胞的增殖具有明確促進(jìn)作用。培養(yǎng)0天時(shí)，各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。培養(yǎng)4天時(shí)，對(duì)照組與不同濃度組之間細(xì)胞增殖速度出現(xiàn)顯著性差異(均P<0.05)，且細(xì)胞增殖速度在低和中濃度組之間、中和高濃度組之間均有顯著性差異(P=0.029及0.022)，提示羊膜支架材料對(duì)早期的細(xì)胞增殖速度影響明顯。培養(yǎng)8天時(shí)，對(duì)照組與其它三組不同濃度之間仍然差異顯著(均P<0.05)。低、中濃度組與高濃度組之間有顯著性差異(均P<0.05)。培養(yǎng)12天時(shí)，對(duì)照組與低、中及高濃度之間細(xì)胞數(shù)有顯著性差異(均P<0.05)，且低濃度組與中、高濃度組之間均有顯著性差異(P=0.049及0.029)。提示隨著培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長，細(xì)胞增殖速度仍明顯受到羊膜支架材料濃度的影響，見圖2。

圖2 不同濃度羊膜支架材料包被培養(yǎng)皿上細(xì)胞增殖活性分析Figure 2 Analysis of cell proliferation activity on culture dishes coated with different concentrations of amniotic membrane scaffold materials注：培養(yǎng)4、8、12天時(shí)，對(duì)照組與不同濃度組之間細(xì)胞增殖速度出現(xiàn)顯著性差異，不同濃度之間也出現(xiàn)增殖速度的差異。平均增殖細(xì)胞數(shù)用OD值表示(每次3個(gè)細(xì)胞孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn))

2.3 hAMC-SP在不同生物材料包被培養(yǎng)皿上培養(yǎng) 把hAMC-SP在對(duì)照組、膠原蛋白I組、脫細(xì)胞人羊膜支架及人細(xì)胞外基質(zhì)(HEM)等生物材料包被培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)，以此比較羊膜來源干細(xì)胞在不同生物材料包被培養(yǎng)皿的生長情況(圖3A)。結(jié)果脫細(xì)胞人羊膜支架材料包被培養(yǎng)皿上干細(xì)胞增殖速度與其他三組相比，差異存在顯著性(均P<0.05)(圖3B)。膠原蛋白I組與HEM組之間無顯著性差異(P=0.127)。

圖3 hAMC-SP在不同生物材料包被培養(yǎng)皿上培養(yǎng)Figure 3 Amniotic membrane-derived stem cells were cultured on different biomaterial-coated culture dishes注：A.羊膜源性干細(xì)胞在不同生物材料包被培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)8天結(jié)果(100×)；B.各種生物材料包被培養(yǎng)皿中羊膜源性干細(xì)胞的培養(yǎng)。培養(yǎng)8天后的平均增殖細(xì)胞數(shù)(OD值)(每次3個(gè)細(xì)胞孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn))。①P<0.05

3 討論

在組織工程領(lǐng)域，支架材料是不可或缺的環(huán)節(jié)。理想的提供細(xì)胞種植的基質(zhì)材料應(yīng)具有以下特點(diǎn)：無毒性、良好的生物組織相容性、生物可降解性及降解可調(diào)節(jié)性，同時(shí)不引起機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度以及良好的表面活性等[18-19]。羊膜的生物學(xué)特性是羊膜成為理想供體材料的物質(zhì)基礎(chǔ)。1910年胎膜第一次被成功地用作皮膚移植的供體材料后[20]，羊膜作為一種生物材料受到廣泛注目。羊膜位于胎盤的最內(nèi)層，其光滑，無血管、神經(jīng)及淋巴，無免疫原性。

1980年Kari等[21]分析了人羊膜上皮細(xì)胞在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的組成，其成分主要為兩種基質(zhì)蛋白，即纖維結(jié)合蛋白和Ⅲ型溶膠原蛋白，還有少量的層粘連蛋白IV型和AB型基膜膠原。羊膜溶液化后的成份鑒定提示，加工處理后的羊膜具有結(jié)構(gòu)和功能性的基質(zhì)特征[22]。華萍等[23]發(fā)現(xiàn)凍干羊膜或新鮮羊膜均具有良好的組織相容性，不會(huì)引起明顯的急性免疫排斥反應(yīng)，作為異體移植材料免疫安全性較好。人羊膜支架不僅具有安全性，同時(shí)含有促進(jìn)細(xì)胞增殖的成分。有研究證實(shí)人羊膜含有纖維黏連素、Ⅳ型膠原及大量硫酸乙酰肝素蛋白多糖，以及其它一些蛋白多糖大分子和神經(jīng)營養(yǎng)因子。Enosawa等[24]發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞不僅表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的特異性蛋白，而且還合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子及神經(jīng)遞質(zhì)。這可能與促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)。楊繼濱等[25]研究發(fā)現(xiàn)人脫細(xì)胞羊膜支架能夠有效促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞黏附，并且未發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)及毒性。日本學(xué)者把羊膜作為一個(gè)基質(zhì)，在羊膜上進(jìn)行了胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，并誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞[26]。作為肝病大國，終末性肝病的治療中干細(xì)胞移植越來越受到矚目，干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)，維持它的干性特征的實(shí)驗(yàn)室研究具有重要意義。

在前期研究中我們從人羊膜成功分離干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了一系列的鑒定，它表達(dá)Oct-4、Sox-2及Rex-1等干細(xì)胞標(biāo)記物，但它不表達(dá)CD34、CD45等造血干細(xì)胞標(biāo)記分子[18]，具有間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。在本研究中我們成功制備了脫細(xì)胞人羊膜支架包被培養(yǎng)皿，并把羊膜中分離的干細(xì)胞在包被培養(yǎng)皿上進(jìn)行了培養(yǎng)，以此探討羊膜支架對(duì)干細(xì)胞增殖速度的影響。結(jié)果提示與未處理過的普通培養(yǎng)皿相比，羊膜源性干細(xì)胞在羊膜支架材料包被的培養(yǎng)皿上增殖率明顯增加，且濃度越高其增殖速度越快，呈線性正相關(guān)性。去除細(xì)胞后的羊膜支架材含有各種類型的膠原纖維、纖維連接蛋白、整合素及層粘連蛋白等分子，這些成分的存在對(duì)細(xì)胞的生長提供三維空間結(jié)構(gòu)，促進(jìn)各種細(xì)胞的粘附，有利于細(xì)胞快速生長。本研究結(jié)果也證明了脫細(xì)胞人羊膜支架材料對(duì)成體干細(xì)胞具有促進(jìn)粘附和增殖作用。羊膜作為廉價(jià)的生物材料，將為細(xì)胞的體外培養(yǎng)、胚胎及成體干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究，以及再生醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用。

本研究的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫細(xì)胞羊膜支架與傳統(tǒng)的膠原纖維及人細(xì)胞外基質(zhì)材料比較，具有更明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖生長的作用，提示羊膜支架材料有著更廣闊的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用研究價(jià)值。來自動(dòng)物的膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿等可能含有動(dòng)物來源的抗原成分，細(xì)胞培養(yǎng)后移植治療時(shí)引起免疫反應(yīng)，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有一定的局限性和風(fēng)險(xiǎn)因素，因此再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中人來源的生物材料具有更重要的意義。細(xì)胞外基質(zhì)除了生物支架作用外，還對(duì)各種干細(xì)胞的粘附、分化、發(fā)育及移行等表現(xiàn)具有及其深遠(yuǎn)影響，其分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步摸索和探討。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)培養(yǎng)后干細(xì)胞的活性及功能未進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)和分析，需要下一步繼續(xù)探討。

各種組織中提取的干細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比在某些細(xì)胞外基質(zhì)包被培養(yǎng)皿上干細(xì)胞呈現(xiàn)較好的黏附，增殖生長速度加快、移行等特點(diǎn)，可以迅速增殖到足夠細(xì)胞數(shù)量以用于移植治療。但來自動(dòng)物的膠原蛋白、纖維蛋白等生物材料包被的培養(yǎng)皿等可能含有動(dòng)物來源的抗原成分，細(xì)胞培養(yǎng)后移植治療時(shí)易引起免疫反應(yīng)。而脫細(xì)胞人羊膜支架材料具有來源廣泛、容易制備、易于保存、不涉及倫理問題及無免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，作為一種特殊的細(xì)胞外基質(zhì)和生物載體，在再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中具有極其廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

脫細(xì)胞人羊膜支架材料有望成為干細(xì)胞研究與再生醫(yī)療領(lǐng)域中的新型生物材料。