錢汐晶，劉燕，吳兵安，戚中田，趙平

（海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系生物醫(yī)學(xué)防護(hù)教研室，上海 200433）

黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）屬于黃病毒科黃病毒屬，是黃熱病的病原體［1-2］。作為一種重要的蟲媒傳播病毒，攜帶病毒的蚊子叮咬是其傳播的主要途徑，也是該病毒在靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類間進(jìn)行傳播的重要途徑［3］。黃熱病目前主要在南美洲和非洲撒哈拉地區(qū)流行［4］。YFV 感染后可累及人體多個(gè)臟器。患者通常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、惡心嘔吐等常見的感染癥狀。但大約20%～60%患者病情會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展，累及到各個(gè)臟器，包括肝脾腦腎等，嚴(yán)重的可發(fā)展為多器官衰竭，出血性休克，甚至死亡［5-6］。盡管黃熱病毒的減毒活疫苗能有效預(yù)防病毒的感染，但由于流行地區(qū)的疫苗覆蓋率低，蟲媒管控措施低下，且該病無有效的治療性藥物，使疫情一直在風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)周期性暴發(fā)［7-8］。從2016年至今，黃熱病多次在巴西、安哥拉等國(guó)暴發(fā)流行，致病致死率一度達(dá)到40%～60%［9-10］。目前，該病的感染范圍還在不斷擴(kuò)大，每年感染人數(shù)高達(dá)20 萬，死亡人數(shù)超過6 萬［11］。我國(guó)也相繼報(bào)道了11 例輸入性病例。這對(duì)國(guó)內(nèi)無免疫屏障的人群來說是非常大的威脅。因此，對(duì)YFV 藥物的研發(fā)非常必要和迫切。

達(dá)塞布韋是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）NS5B 的RNA 聚合酶抑制劑［12］。作為一種新型非核苷類聚合酶抑制劑，可阻斷HCV RNA 的復(fù)制。臨床上，達(dá)塞布韋聯(lián)合其他幾款直接作用的抗病毒藥物（direct-acting antiviral agents，DAAs）用于治療HCV 慢性感染的患者［13］。近期研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)塞布韋還具有抑制其他蟲媒病毒感染的作用。該小分子能在體外實(shí)驗(yàn)中抑制寨卡病毒、西尼羅病毒和森林腦炎病毒在Vero 細(xì)胞中復(fù)制［14］。然而，其在YFV 感染中的作用未見報(bào)道。通過篩選FDA 小分子藥物庫，我們發(fā)現(xiàn)達(dá)塞布韋能有效抑制YFV 感染。本研究進(jìn)一步就其抗病毒效果和機(jī)制進(jìn)行了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增

人肝癌Huh7 細(xì)胞、非洲猴腎Vero 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)均使用含10%胎牛血清、2 mmol／L L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、100 U／mL 青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。YFV 疫苗株（YFV-17D）在Vero 細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增［15］。病毒感染后，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收集上清。病毒分裝后存儲(chǔ)在-80 ℃冰箱。病毒滴度通過空斑形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2 試劑與抗體

達(dá)塞布韋（貨號(hào)：HY-13998）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司。CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM Ⅰ培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA 均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。小鼠Alexa Fluor?488 二抗、DAPI、TRIzol 試劑、DMSO 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。小鼠抗YFV多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室利用甲醛滅活的YFV 全病毒免疫小鼠制備純化獲得。

1.3 CCK-8 細(xì)胞毒性檢測(cè)

Huh7 細(xì)胞提前一天種于96 孔板中。第二日，將不同濃度的達(dá)塞布韋（0.04、0.2、1、5、25、125、625 μM）加入孔板中，同時(shí)以同濃度的DMSO 作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。檢測(cè)時(shí)，將上清吸去，每孔加入濃度10%的CCK-8 試劑室溫孵育1 h。隨后孔板用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的A值，測(cè)算出不同濃度達(dá)塞布韋作用下的細(xì)胞存活情況，并計(jì)算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）［16］。

1.4 YFV 感染檢測(cè)

Huh7 細(xì)胞提前一天種于孔板中。第二日，加入YFV（MOI=1）感染6 h。同時(shí)加入不同濃度的達(dá)塞布韋（0.04、0.2、1、5、25、125 μM）。病毒感染后24 h，分別利用免疫熒光法（IF）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞感染情況［17］。使用IF 時(shí)，將細(xì)胞用冰甲醇固定，封閉后依次加入小鼠抗YFV 多克隆抗體及抗小鼠Alexa Fluor?488 二抗。細(xì)胞核用DAPI 進(jìn)行染色后，用BioTek Cytation 5 細(xì)胞成像儀分析免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，評(píng)價(jià)達(dá)塞布韋抗YFV 感染的劑效關(guān)系，并計(jì)算IC50。使用RT-qPCR 時(shí)，將細(xì)胞用TRIzol 裂解后，抽提細(xì)胞內(nèi)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過特異性的YFV 引物，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)YFV RNA 的表達(dá)量。引物見表1。

表1 引物序列表

1.5 YFV 感染的動(dòng)力時(shí)間窗實(shí)驗(yàn)

Huh7 細(xì)胞提前一天種于孔板中。第二日，分別在加入病毒感染前6 h、加入病毒同時(shí)、病毒感染后6、12、18 h 加入達(dá)塞布韋（25 μM）。藥物作用時(shí)間和病毒感染時(shí)間均為6 h。以相同濃度的DMSO 作為對(duì)照。病毒感染24 h 后，通過IF 檢測(cè)藥物在病毒感染不同時(shí)期的抗病毒效果。

1.6 YFV 復(fù)制效率的檢測(cè)

構(gòu)建帶有NanoLuc 報(bào)告基因的YFV-17D 的復(fù)制子質(zhì)粒［18］。將該質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄（HiScribe T7 ARCA mRNA 試劑盒）獲得YFV 復(fù)制子RNA。利用LipofectamineTM2000 將RNA 轉(zhuǎn)染入Huh7 細(xì)胞中，6 h 后換液。同時(shí)，加入不同濃度的達(dá)塞布韋，檢測(cè)藥物對(duì)病毒復(fù)制效率的影響。轉(zhuǎn)染后24 h，將上清換為含有10%NanoLuc 的培養(yǎng)基，避光孵育5 min。利用ChemiScope 6000 成像系統(tǒng)對(duì)活細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行測(cè)定。隨后，細(xì)胞固定后再進(jìn)行IF 檢測(cè)。

1.7 達(dá)塞布韋與YFV NS5 亞基的親和力檢測(cè)

將YFV-17D NS5 蛋白的序列構(gòu)建到了pET-32a的載體中。隨后，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，并用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。蛋白的表達(dá)和分子量大小通過電泳和考馬斯亮藍(lán)染色確定。蛋白進(jìn)一步通過Ni-NTA 親和層析柱進(jìn)行純化，并通過質(zhì)譜檢測(cè)。以上過程均由近岸蛋白質(zhì)科技公司協(xié)助完成。

達(dá)塞布韋與NS5 亞基的相互作用通過表面等離子共振法檢測(cè)，使用BIAcoreTM8K 生物分析儀。達(dá)塞布韋溶于含有5%DMSO 的PBS 中制成不同濃度的化合物溶液。首先，將純化的病毒蛋白結(jié)合到CM5 的S 系列芯片上（美國(guó)GE 公司）。隨后，分析物以30 μL／min 的流速注入［19］。記錄小分子溶液的信號(hào)響應(yīng)值。同時(shí)，無小分子的溶液的信號(hào)響應(yīng)值作為空白對(duì)照，將從原始的數(shù)據(jù)中剔除出去。使用BIAcore 8K 評(píng)估分析軟件評(píng)價(jià)小分子與蛋白間的結(jié)合動(dòng)力，同時(shí)計(jì)算出KD 值［20］。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析。處理組與對(duì)照組（DMSO 組）比較采用單因素方差分析或卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)塞布韋細(xì)胞毒性較低，能有效抑制YFV 感染

為檢測(cè)達(dá)塞布韋在YFV 靶細(xì)胞中的毒性作用，我們首先檢測(cè)了不同濃度藥物對(duì)Huh7 細(xì)胞的影響。根據(jù)CCK-8 細(xì)胞活性檢測(cè)的結(jié)果，當(dāng)達(dá)塞布韋濃度達(dá)到625 μM 時(shí)，觀察到明顯的細(xì)胞毒性，CC50為346.1 μM（圖1A）。利用不同濃度的小分子化合物處理感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)達(dá)塞布韋能顯著抑制YFV 病毒的感染，細(xì)胞內(nèi)病毒RNA 的水平明顯下降，病毒蛋白表達(dá)量顯著降低，且呈濃度依賴的形式（圖1B、1C）。經(jīng)過計(jì)算達(dá)塞布韋抑制YFV 感染的IC50 為7.253 μM，其選擇指數(shù)（SI 值）為47.7。

圖1 達(dá)塞布韋的細(xì)胞毒性和抗YFV 活性作用

2.2 達(dá)塞布韋在YFV 感染后期階段發(fā)揮抗病毒作用

我們進(jìn)行了藥物作用動(dòng)力時(shí)間窗的實(shí)驗(yàn)，以明確達(dá)塞布韋抗病毒起效的階段。在病毒感染的不同階段加入化合物，觀察哪個(gè)階段對(duì)病毒感染的抑制作用最明顯（圖2A）。結(jié)果顯示，在YFV 感染6 h 后加入達(dá)塞布韋，開始具有抗病毒的效果，并且在12～18 h加入化合物時(shí)抑制效果最為明顯。在病毒感染18 h后再加入達(dá)塞布韋，抑制效果明顯下降。這與病毒復(fù)制的時(shí)間段基本一致（圖2B）。

圖2 YFV 感染不同階段加入達(dá)塞布韋對(duì)病毒感染的影響

2.3 達(dá)塞布韋可抑制YFV RNA 的復(fù)制效率

為了研究達(dá)塞布韋對(duì)YFV 復(fù)制的作用，我們構(gòu)建了帶有NanoLuc 報(bào)告基因的YFV-17D 的復(fù)制子質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，我們用不同濃度的藥物處理該細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)YFV 復(fù)制效率的影響。結(jié)果顯示，達(dá)塞布韋能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)病毒RNA 的復(fù)制效率，且該抑制效果呈濃度依賴，抑制率基本與在細(xì)胞感染下觀察到的一致（圖3A、3B）。同時(shí)，我們還用免疫熒光法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，YFV 蛋白的表達(dá)也與病毒RNA 的抑制效果一致（圖3C）。

圖3 達(dá)塞布韋對(duì)YFV 復(fù)制子的抑制作用

2.4 達(dá)塞布韋通過與NS5 蛋白相互作用抑制病毒復(fù)制

在YFV 復(fù)制過程中，NS5 蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，具有RNA 依賴的RNA 聚合酶的作用。因此，我們檢測(cè)了達(dá)塞布韋與NS5 蛋白之間的相互作用。通過表面等離子共振法（SPR）BIAcore 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，達(dá)塞布韋可有效與NS5 蛋白結(jié)合，KD 值為7.11 μM（圖4）。此結(jié)果進(jìn)一步提示，小分子化合物達(dá)塞布韋抑制病毒的復(fù)制很大可能是通過影響該蛋白的活性。

圖4 達(dá)塞布韋與YFV NS5 蛋白的親和力測(cè)定

3 討論

YFV 目前仍舊在南美洲和非洲等流行地區(qū)周期性爆發(fā)［21］。作為首個(gè)發(fā)現(xiàn)的出血熱病毒和重要的蟲媒病毒，YFV 對(duì)全球的公共衛(wèi)生造成了重大的壓力［22］。目前，黃熱病主要的控制手段就是接種疫苗和蟲媒管控。但對(duì)于高發(fā)流行地區(qū)來說，這些措施可能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。研發(fā)高效、特異性靶向的抗病毒藥物，能有效降低感染患者的致病致死率。達(dá)塞布韋作為一種上市的抗HCV 藥物，長(zhǎng)期在臨床上運(yùn)用，藥物代謝、臨床安全性等數(shù)據(jù)都較為明確。通過本研究發(fā)現(xiàn)，達(dá)塞布韋具有顯著的抗YFV 感染的作用。其抗病毒活性在病毒感染后期發(fā)揮得最為明顯。我們推測(cè)達(dá)塞布韋通過與YFV 復(fù)制關(guān)鍵的NS5 中RNA 依賴的RNA 聚合酶相互作用，影響了該酶的生物學(xué)活性，抑制了病毒的復(fù)制，從而干擾了病毒的感染。

在YFV 的生命周期中，復(fù)制是控制整個(gè)過程的關(guān)鍵［23］。作為復(fù)制階段至關(guān)重要的酶，RNA 聚合酶是藥物研發(fā)的重點(diǎn)。病毒聚合酶在各類病毒中都是最為保守的酶類之一［24］。許多病毒的治療中都有針對(duì)聚合酶的抑制劑如HCV 治療中的索非布韋、達(dá)塞布韋，流感病毒的治療性藥物中的法匹拉韋、巴洛沙韋，新冠病毒治療中運(yùn)用到的瑞德西韋等［25-27］。黃病毒涵蓋一大類病毒，病毒間的聚合酶在結(jié)構(gòu)有較大的相似性。將已上市的抗黃病毒的聚合酶抑制劑進(jìn)行老藥新用，發(fā)現(xiàn)其新的抗病毒作用，將大大縮短藥物研發(fā)的周期，對(duì)于無治療藥物的新發(fā)再發(fā)傳染病的治療是理想的方法。

本研究從細(xì)胞水平上對(duì)達(dá)塞布韋抗YFV 活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)其主要的抗病毒階段進(jìn)行了定位，并對(duì)其涉及的抗病毒機(jī)制進(jìn)行了初步探索。在本研究中，發(fā)現(xiàn)了達(dá)塞布韋與病毒NS5 蛋白間的相互作用。然而，該化合物與蛋白的作用位點(diǎn)及方式仍未確定。未來，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)達(dá)塞布韋抗YFV 感染靶點(diǎn)的具體機(jī)制進(jìn)行明確。同時(shí)，作為一種抗病毒藥物，其體內(nèi)的抗病毒活性仍舊需要全面評(píng)價(jià)。