王馨，劉健，文建庭，忻凌，姜輝，萬(wàn)磊，孫玥，王桂珍，陳瑞蓮

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatiod arthritis，RA）是一種以滑膜對(duì)稱性炎癥和血管翳形成為特征的慢性全身性疾病，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨的進(jìn)行性破壞［1］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前仍未完全闡 明?；こ衫w維樣細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是RA 的間充質(zhì)干細(xì)胞，激活RAFLS 可導(dǎo)致大量細(xì)胞表面和可溶性介質(zhì)的產(chǎn)生，這些介質(zhì)有助于招募、保留和激活免疫細(xì)胞和常駐關(guān)節(jié)細(xì)胞，從而導(dǎo)致炎癥和組織破壞［2］。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)體內(nèi)組織成分動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵機(jī)制［3］。凋亡不足的RA-FLS 和炎性因子相互作用推動(dòng)了RA 的病理狀態(tài)，促進(jìn)RA-FLS 凋亡是RA 的新型治療思路［4］。RA 患者體內(nèi)常存在血管翳的形成，表現(xiàn)為凝血纖溶系統(tǒng)的異常［5］。

生物制劑在過(guò)去的10 年中己成為治療RA 的主要突破點(diǎn)。在患者外周血以及滑膜局部高表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)顯示TNF-α 中和后減少其他炎性因子的分泌，抑制RA-FLS 的增殖，促進(jìn)其凋亡，因此將拮抗TNF-α 作為治療RA 靶點(diǎn)。臨床試驗(yàn)表明TNF-α治療不但能夠改善患者的癥狀和提高功能，而且可以有效控制病情的進(jìn)展［6］。因此，本實(shí)驗(yàn)選取TNF-α 刺激的RA-FLS 作為對(duì)照模型組。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）是新近發(fā)現(xiàn)的一類非蛋白編碼RNAs［7］，其失調(diào)與多種疾病包括風(fēng)濕免疫類疾病有關(guān)［8-10］。近期研究發(fā)現(xiàn)，MIR22HG 在肝癌中低表達(dá)，MIR22HG 過(guò)表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。本課題組前期選取了3 名RA 患者和3名健康對(duì)照者的PBMC 進(jìn)行RNA 測(cè)序。使用生物信息學(xué)篩選了幾種與細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA。發(fā)現(xiàn)與正常人相比，MIR22HG 在RA 中表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［12］。細(xì)胞凋亡是指在基因嚴(yán)格控制下，由促凋亡蛋白（Bax、Bak 及Bad 等）、抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL 及Bcl-w 等）和凋亡調(diào)控因子（Caspase 家族等）等共同參與下的細(xì)胞有序性死亡［13］。Caspase-3 是重要的細(xì)胞凋亡通路。Caspase-3 激活是細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段的標(biāo)志［14］。

黃芪總皂苷是中藥黃芪的藥效成分之一［15］，現(xiàn)代藥理表明皂苷類有多種藥理活性，包括免疫調(diào)節(jié)、多器官保護(hù)、降血糖、抗病毒、抗腫瘤等［16］，在心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病中多有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷能增強(qiáng)可降低大鼠缺血／再灌注腦損傷模型中Caspase-3 基因的表達(dá)［17］，還能誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡［18］。但AST 對(duì)RA 的具體作用機(jī)制尚未進(jìn)行研究。因此，本文旨在從凋亡和凝血兩個(gè)方面對(duì)AST 調(diào)節(jié)MIR22HG／Caspase-3 信號(hào)通路影響RA 進(jìn)行探索。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2021 年3 月至5 月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院RA 住院患者30 例，同期同一醫(yī)院健康體檢中心正常人30 例。用肝素鈉抗凝管清晨空腹留取靜脈血4 mL，利用Ficoll 提取人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），保存至-80 ℃冰箱備用。本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2019AH-12）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）聯(lián)合歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)［19-20］；有完整的治療前后實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18 歲以下，75 歲以上者；合并有心、肝、腎等嚴(yán)重疾病以及嚴(yán)重關(guān)節(jié)外表現(xiàn)；孕婦或哺乳期女性；精神病患者；應(yīng)用免疫抑制劑和生物制劑的患者。

1.2 分組及觀察指標(biāo)

選擇30 例健康體檢人群為正常組，選取30 例RA 住院患者為RA 組，比較正常組和RA 組PBMC細(xì)胞中MIR22HG 水平、凝血和凋亡指標(biāo)。臨床指標(biāo)：LncRNA：MIR22HG；凝血指標(biāo)：血小板活化因子（PAF）和前列腺素I2（PGI2）；凋亡指標(biāo)：B 細(xì)胞淋巴瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase-8）。

1.3 藥物與試劑

黃芪總皂苷（total astragalus saponins，AST；原料藥，純度99.99%）購(gòu)自上海源葉生物公司，批號(hào)為J30N9T76378；人PBMC 分離液（天津?yàn)笊锕荆?，TRIzol 試劑（美國(guó)Life technogies 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司），實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒（上海塞默飛世爾科技公司，型號(hào)：PIKOREAL 96），胎牛血清（浙江天杭生物公司）；ELISA 試劑盒（武漢基因美生物科技公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公 司）；pcDNA3.1-NC 和 pcDNA3.1-MIR22HG（上海吉瑪制藥技術(shù)公司）。DMEM 培養(yǎng)基（上海吉瑪制藥技術(shù)公司）；Caspase-3、Caspase-8、Bax（小鼠抗人）和Bcl-2（小鼠抗人）（英國(guó)Abcam 公司）；DAPI（北京索萊寶科技公司）；Fluoromount-G 熒光封片劑（美國(guó)Sourthern Biotech公司）。

高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自安徽嘉文儀器裝備有限公司（型號(hào)：JW-3021HR），PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州晶格科學(xué)儀器有限公司（型號(hào)：K960）。高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司，JW-3021HR）；酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司，RT-6000）

1.4 細(xì)胞系培養(yǎng)

將RA-FLS 培養(yǎng)于含100 U／mL 濃度青霉素和0.1mg／mL 濃度鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中、于5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí)即可傳代。將pcDNA3.1-MIR22HG 與陰性對(duì)照用Li-pofectamine2000 轉(zhuǎn)染至RA-FLS 中，繼續(xù)孵育24 h。

TNF-α 可誘導(dǎo)RA-FLS 發(fā)生持續(xù)炎癥反應(yīng)，本團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)TNF-α 刺激RA-FLS 最佳濃度和時(shí)間分別為10 ng·mL-1和48 h。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)MIR22HG、Bax mRNA 和Bcl-2 mRNA

用TRIzol 從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中提取總RNA。用TAKARA 試劑盒反轉(zhuǎn)錄1 μg 總RNA。具體反應(yīng)條件為：95 ℃（30 s），然后分別以94 ℃（15 s）、45 ℃（45 s）和72 ℃（45 s）循環(huán)40 次。本研究中使用的引物如表1 所示。β-actin 被用作內(nèi)參基因。用2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.6 ELISA 檢測(cè)PAF 和TXB2

收集各組RA-FLS 培養(yǎng)上清液，1 000 r／min 離心10 min，棄去沉淀。將上清液加入酶標(biāo)板中（每孔100 uL），37℃孵育1.5 h，采用ELISA 方法，嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)血清中PAF 和PGI2。

1.7 Western Blot 檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Bax 和Bcl-2

用RIPA 緩沖液純化滑膜細(xì)胞中的Western Blot蛋白。SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液也用于蛋白質(zhì)分離。用凝膠電泳法分離蛋白，以每孔5～10 uL 將蛋白加入SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)。采用特異性單克隆抗體Caspase-3、Bax、Bcl-2 和Caspase-8。重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

（1）相關(guān)性分析 采用Spearman 相關(guān)性分析分析MIR22HG 與凋亡和凝血指標(biāo)之間關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（2）關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 采用SPSS Modeler 18.0 中的Aprior 模塊分析MIR22HG 與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性?！坝小比≈刀椤癟”，“無(wú)”取值定為“F”。指標(biāo)改善定為“T”，指標(biāo)未改善定為“F”。包括補(bǔ)充缺失數(shù)據(jù)，剔除錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。計(jì)算公式［22］如下：

2 結(jié)果

2.1 RA 患者M(jìn)IR22HG、凝血和細(xì)胞凋亡指標(biāo)的變化

與正常組相比，RA 患者M(jìn)IR22HG、PAF、Bcl-2 mRNA 升高，PGI2、Bax mRNA 降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 RA 患者M(jìn)IR22HG、凝血和凋亡指標(biāo)的變化（）

表2 RA 患者M(jìn)IR22HG、凝血和凋亡指標(biāo)的變化（）

注：與NC 組比較，aP＜0.05

2.2 RA 患者M(jìn)IR22HG 與凋亡指標(biāo)和凝血指標(biāo)的相關(guān)性及關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

相關(guān)性分析顯示，PAF、Bcl-2 與MIR22HG 呈正相關(guān)，PGI2、Bax 與MIR22HG 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 RA 患者M(jìn)IR22HG 與凋亡指標(biāo)和凝血指標(biāo)的相關(guān)性分析

設(shè)定后項(xiàng)為MIR22HG，前項(xiàng)為凋亡、凝血指標(biāo)，最小支持度為20%，最小置信度為60%。經(jīng)Aprior模塊分析，MIR22HG 表達(dá)升高與Bax、PGI2 降低和PAF、Bcl-2 升高的支持度＞45%、置信度＞95%、提升度＞1。見(jiàn)表3。

表3 MIR22HG 與RA 患者凋亡凝血的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.3 AST 抑制RA-FLS 活力

使用不同濃度（5%／10%／20%／50%）AST 分別作用于RA-FLS 12／24／48／72 h，選取細(xì)胞活力值接近0.5 時(shí)的AST 最佳作用濃度和時(shí)間為20%，48 h。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度AST 處理12／24／48／72 h 后RA-FLS 的活力

2.4 AST 降低RA-FLS 中MIR22HG 的表達(dá)

與RA-FLS 組相比，經(jīng)TNF-α 刺激后，RA-FLS的MIR22HG 的表達(dá)升高（P＜0.05）；AST 干預(yù)后，MIR22HG 的表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 黃芪總皂苷降低RA-FLS 中MIR22HG 的表達(dá)

2.5 AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 對(duì)凋亡指標(biāo)Bcl-2 mRNA 和Bax mRNA 的影響

與TNF-α＋RA-FLS 組相比，經(jīng)AST 干預(yù)后，Bax mRNA 表達(dá)升高、MIR22HG 和Bcl-2mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC 組相比，經(jīng)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIR22H 后，Bax mRNA 表達(dá)降低、MIR22HG 和Bcl-2mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 RT-qPCR 法檢測(cè)AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 對(duì)RA-FLS 凋亡蛋白的影響

2.6 AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 和凋亡通路Caspase-3 對(duì)凋亡指標(biāo)Caspase-8、Bax 和Bcl-2 蛋白的影響

與TNF-α＋RA-FLS 組相比，經(jīng)AST 干預(yù)后，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 8（caspase8）蛋白表達(dá)升高。與pcDNA3.1-NC 組相比，pcDNA3.1-MIR22HG 組Bcl-2 蛋白表達(dá)升高，Caspase-3、Caspase-8 和Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 和凋亡通路Caspase-3 對(duì)凋亡指標(biāo)Caspase-8、Bax 和Bcl-2 蛋白的影響

2.7 AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 對(duì)RA-FLS 凋亡的影響

用NovoExpress 軟件對(duì)流式細(xì)胞凋亡的圖像進(jìn)行分析，1 象限代表壞死細(xì)胞，2 象限代表晚期凋亡細(xì)胞，3 象限代表早期凋亡細(xì)胞，4 象限代表正常細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算2＋3／1＋2＋3＋4 的細(xì)胞比例反映細(xì)胞的凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與TNF-α＋RAFLS 組相比，經(jīng)AST 干預(yù)后細(xì)胞凋亡增多（P＜0.05），與pcDNA3.1 -NC 組相比，pcDNA3.1 -MIR22HG 組細(xì)胞凋亡降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 對(duì)RA-FLS 凋亡的影響

2.8 AST 通過(guò)調(diào)控Caspase-3 信號(hào)通路對(duì)RA-FLS凋亡蛋白的影響

與TNF-α ＋RA-FLS 組相比，經(jīng)AST 或PETCM干預(yù)后，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax、Caspase-3 和Caspase-8 蛋白表達(dá)升高（均P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 WB 法檢測(cè)AST 通過(guò)調(diào)控Caspase-3 信號(hào)通路對(duì)RA-FLS 凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8 的影響

2.9 AST 通過(guò)調(diào)控MIR22HG 和Caspase-3 信號(hào)通路對(duì)凝血指標(biāo)PAF 和PGI2 的影響

與TNF-α＋RA-FLS 組相比，經(jīng)AST 干預(yù)后，PAF降低、PGI2 升高，與pcDNA3.1-NC 組相比，轉(zhuǎn)染pc3.1-MIR22HG 后PAF 升高、PGI2 降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 ELISA 法檢測(cè)AST 通過(guò)下調(diào)MIR22HG，上調(diào)Caspase-3 信號(hào)通路對(duì)RA-FLS 凝血因子PAF、PGI2 的影響

3 討論

RA 是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)炎，其特征是滑膜的凋亡不足、增生過(guò)度和血管翳的形成。滑膜細(xì)胞是滑膜關(guān)節(jié)的間質(zhì)細(xì)胞，被認(rèn)為在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用［23］。AST 是黃芪家族的一員，已經(jīng)證明它可以增加巨噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫力［24］。通過(guò)選取臨床30 例RA 患者和正常人的PBMC，檢測(cè)MIR22HG 及凋亡凝血等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)RA 患者體內(nèi)RA 組MIR22HG 高表達(dá)，且存在凋亡和凝血指標(biāo)的異常。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PAF、Bcl-2 與MIR22HG 呈正相關(guān)，PGI2、Bax與MIR22HG 呈負(fù)相關(guān)。關(guān)聯(lián)規(guī)則結(jié)果顯示，MIR22HG 表達(dá)升高與Bax、PGI2 降低和PAF、Bcl-2升高的支持度＞45%、置信度均＞95%、提升度均＞1。說(shuō)明RA 患者體內(nèi)存在凋亡不足和高凝狀態(tài)，同時(shí)檢測(cè)到異常表達(dá)的MIR22HG，但他們之間是否存在調(diào)控關(guān)系仍不可知，因?yàn)楸狙芯恐荚陉U明AST 影響RA-FLS 的分子機(jī)制。

首先，用不同濃度AST 處理RA-FLS12、24、48、72 h 后觀察其細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)在20%AST 處理RAFLS 48 h 時(shí)細(xì)胞活力受到明顯抑制，因此，選取此最佳處理濃度和時(shí)間進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。為了闡明相關(guān)的分子機(jī)制，用RT-qPCR 方法觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)AST 處理后RA-FLS 中MIR22HG 明顯降低，說(shuō)明AST 可下調(diào)RA-FLS 中MIR22HG 的表達(dá)。Bax 和Bcl-2 是同屬BcI-2 家族蛋白，是作用互為拮抗的2 種凋亡調(diào)控蛋白。正常情況下，Bax 和Bcl-2 以適當(dāng)比例存在，參與細(xì)胞的基本生理過(guò)程，當(dāng)細(xì)胞受到外界凋亡信號(hào)后，二者的含量或比例發(fā)生變化［25］。本文研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AST 處理后，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高。說(shuō)明AST 可以增加促凋亡蛋白的表達(dá)，減少抑凋亡蛋白的表達(dá)，維持RA-FLS 的凋亡平衡。當(dāng)Bax 表達(dá)增多時(shí)，形成的Bax／Bax 同二聚體明顯增多，使線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C 釋放增多，激活Caspase 家族蛋白，特別是Caspase3 信號(hào)通路蛋白。WB 結(jié)果顯示，經(jīng)AST 處理后，Caspase3、Caspase8 等促凋亡蛋白升高。

MIR22HG 是一種和凋亡相關(guān)的基因，已在癌癥中發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［26］。WB 和RT-qRCR 顯示，轉(zhuǎn)染MIR22HG 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，Bax 表達(dá)均降低、MIR22HG、Bcl-2 的表達(dá)均升高，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MIR22HG 可挽救RA-FLS 的細(xì)胞凋亡能力，說(shuō)明AST 是通過(guò)抑制MIR22HG 來(lái)發(fā)揮促凋亡作用的。

細(xì)胞膜表面的死亡受體受到胞外死亡信號(hào)刺激，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C 至胞漿，與Caspase9及凋亡酶激活因子1（Apaf-1）等形成即調(diào)亡小體，繼而在 ATP 的作用下 Caspase9 酶切并激活Caspase3，使其由無(wú)活性的Procaspase3 酶原轉(zhuǎn)化為有活性的cleaved-Caspase3，啟動(dòng)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡［26］。因此Caspase-3 是關(guān)鍵的凋亡信號(hào)通路。使用AST 或Caspase 信號(hào)通路激動(dòng)劑PETCM 作用于RA-FLS，與TNF-α＋RA-FLS 組相比，經(jīng)AST 或PETCM 干預(yù)后，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax、Caspase-3 和Caspase-8 蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明AST 發(fā)揮與Caspase-3 通路激動(dòng)劑類似的作用，可以促進(jìn)RA-FLS 的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，AST 可通過(guò)下調(diào)MIR22HG，激動(dòng)Caspase-3 信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡，降低凝血因子的水平，從而發(fā)揮治療RA 的作用，本文尚存在局限性和不足之處，比如全文對(duì)RA-FLS 細(xì)胞進(jìn)行機(jī)制研究，缺少RA 患者的體內(nèi)臨床驗(yàn)證，未來(lái)將進(jìn)一步完善對(duì)AST 療效的體內(nèi)驗(yàn)證。