杜茹蕓，王亮，林毅侃

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233）

0 引言

牛奶及其制品作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白補充來源的食物，幾千年前就已經(jīng)被人類用來補充營養(yǎng)，也是目前世界上主流國家官方營養(yǎng)推薦的食品之一。從營養(yǎng)學的角度來看，牛奶及其制品可以滿足人類對于蛋白質(zhì)日常需求的20%~28%，其中年齡越小對于牛奶等乳制品的需求量也會越大[1-3]。乳制品中的活性蛋白，除了有著較高的營養(yǎng)價值外，還有諸多的生物活性功能，對于人體的腸道、血糖、血脂以及骨骼等都有不同的功效[4-7]。

牛乳蛋白質(zhì)主要分為酪蛋白和乳清蛋白，分別占牛乳蛋白質(zhì)的80%和20%。牛乳中的乳清蛋白又包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白以及免疫球蛋白等，其中α-乳白蛋白是乳清蛋白中含量第二豐富的蛋白質(zhì)，約占乳清蛋白的20%。α-乳白蛋白的分子量較小，約為14 000 u，從而易于吸收，可以有效減輕老年人和嬰幼兒的腎臟負擔，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源。α-乳白蛋白富含的色氨酸是神經(jīng)發(fā)育的重要因子，能夠顯著改善嬰幼兒以及成人的睡眠質(zhì)量。α-乳白蛋白在牛乳中含量較低，只占總蛋白的2%~3%。母乳中則含量較高，占總蛋白的20%~25%。因此越來越多的嬰幼兒配方乳粉額外添加α-乳白蛋白，使其含量接近母乳水平。其他一些針對特殊人群的配方粉中也可能添加了α-乳白蛋白[8-10]。

乳制品和嬰幼兒配方乳粉中α-乳白蛋白含量的檢測技術一直是研究熱點，常規(guī)的分析蛋白的方法包括免疫學方法（ELISA）、液相色譜法、毛細管電泳、LCMS的方法等等。其中ELISA的方法取決于抗體的特異性，成本較高并且定量的準確性不能保證。毛細管電泳法受限于儀器的應用沒有那么全面，很多企業(yè)和機構都沒有配備。LC-MS方法需要酶解以及合成特異性的肽段，操作復雜，對于人員要求較高，且酶解過程不可控[11-18]。因此，液相色譜法相對來說應用最廣泛，由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分子量太過接近，需要選取合適的體積排阻色譜柱對兩種蛋白進行分離，從而準確測得α-乳白蛋白的含量。

本研究選取了合適的體積排阻色譜柱，并且不僅針對于嬰幼兒配方產(chǎn)品，還將同樣有市場需求的乳清粉和牛乳中的α-乳白蛋白的含量檢測進行了研究，從而開發(fā)了一種可以同時用于檢測嬰幼兒配方牛乳粉、牛乳清粉以及牛乳中α-乳白蛋白含量的檢測方法，并且對市場上多批次的產(chǎn)品進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

40批次嬰幼兒配方乳粉和10批次牛奶來源于網(wǎng)絡及超市購買、10批次乳清粉由企業(yè)提供。

α-乳白蛋白標準品（牛源，純度≥85%）、β-乳球蛋白標準品（牛源，純度≥85%），美國Sigma公司；β-巰基乙醇，上海普譽科貿(mào)有限公司；鹽酸胍(優(yōu)級純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇，美國Sigma公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸、鹽酸、氫氧化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters 2695高效液相色譜儀帶DAD檢測器，美國Waters公司；MS304S電子分析天平（感量0.1 mg），瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；GL-88B漩渦混合器，其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 流動相配制

緩沖溶液：稱取56.6 g磷酸氫二鈉、3.5 g磷酸二氫鈉和2.9 g乙二胺四乙酸，將其溶解到800 mL水中，測量p H，如有必要，用50%氫氧化鈉溶液或鹽酸將p H調(diào)節(jié)到7.0±0.5。將溶液轉移至1 000 mL容量瓶，用水定容至1 000 mL。

流動相：稱取573 g鹽酸胍，置于1 000 mL廣口錐形瓶中，添加100 mL緩沖溶液，再用水將該溶液稀釋到約900 mL，同時不停攪拌，用50%氫氧化鈉溶液，將p H調(diào)節(jié)到7.0±0.5。將溶液轉移至1 000 m L容量瓶中，并用水定容至刻度。0.45μm濾膜過濾。

1.3.2 標準溶液配制

由于β-乳球蛋白的分子量與α-乳白蛋白接近，是干擾α-乳白蛋白測定的主要蛋白，因此每次進標準樣品都需要加上β-乳球蛋白用于判定兩者的分離情況。

標準儲備液：根據(jù)每批次標準品提供的COA分析證書，稱取含有10 mg（精確到0.1 mg）α-乳白蛋白標準品和10 mg（精確到0.1 mg）β-乳球蛋白標準品，置于10 m L容量瓶，用水充分溶解后定容，作為α-乳白蛋白和β-乳球蛋白混合標準儲備液，濃度為1.0 mg/mL。

標準曲線溶液：分別移取標準儲備液0.25、0.5、1.25、2.5、5 m L至10 m L容量瓶中，用流動相溶解并定容至刻度，配成濃度為10、25、50、125、250、500 mg/L的標準工作溶液。標準工作溶液應現(xiàn)用現(xiàn)配。分別取1.5 m L配置好的標準工作溶液，分別加入10μL 2-巰基乙醇，旋緊瓶蓋，劇烈振蕩10 s，置于室溫下2 h后再進行高效液相色譜分析。制備好的標準曲線溶液應在48 h內(nèi)測定。

1.3.3 樣品前處理

（1）牛奶：稱取0.5 g牛奶，置于10 m L容量瓶中，加入流動相定容至10 mL，溶液備用。

（2）奶粉：稱取1.0 g奶粉，置于10 m L容量瓶中，加水使樣品溶解，如樣品溶解不完全，可使用超聲儀超聲，應保持樣品溫度不高于30℃，樣品完全溶解后，加水定容至10 m L。吸取1.0 m L溶解后的樣品至10 m L容量瓶中，加流動相定容至10 m L，溶液備用。

（3）乳清粉樣品：稱取1.0 g乳清粉樣品，置于100 mL容量瓶中，加水使樣品完全溶解后，用水定容至100 mL。吸取一定量溶解后的樣品至10 mL容量瓶中，用流動相進行稀釋，使α-乳白蛋白的含量在標準曲線范圍內(nèi)，溶液備用。

（4）還原反應：取上述備用溶液1.5 m L，加入10μL 2-巰基乙醇，旋緊瓶蓋，劇烈振蕩10 s，置于室溫下2 h后再進行儀器分析。制備好的樣品應在48 h內(nèi)進行測定。

1.3.4 色譜儀器條件

（1）高效液相色譜儀:Waters 2695帶二極管陣列檢測器；色譜柱：體積排阻色譜保護柱：MAbPac SEC-1G 5μm（4 mm×50 mm）；體積排阻色譜柱：兩根M AbPac SEC-1 300（7.8 mm×300 mm）；流動相：6 mol/L鹽酸胍；流速：0.5 m L/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25℃；進樣量：50μL。

（2）試樣溶液的測定。取50μL樣品溶液注入高效液相色譜儀,在色譜條件下測定試樣的響應值(峰面積)。由校準工曲線線性回歸方程計算樣品溶液中α-乳白蛋白的含量。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

由于β-乳球蛋白的分子量與α-乳白蛋白較為接近，為了確認α-乳白蛋白以及β-乳球蛋白的分離情況，用本方法測定α-乳白蛋白時，需要將α-乳白蛋白以及β-乳球蛋白的標準溶液同時進樣。在200 nm～400 nm的范圍內(nèi)進行二極管陣列掃描，β-乳球蛋白的得到其特征吸收光譜圖。兩個蛋白在280 nm左右吸收峰都較強，因此，確定280 nm為α-乳白蛋白檢測波長。

2.1.2 流動相的確定

乳粉、牛奶、乳清粉的加工過程中不可避免的會使用到熱處理工藝，乳清蛋白對熱較為敏感，不可避免的會發(fā)生一點的空間結構變化以及聚合。6 mol/L鹽酸胍是常用的蛋白變性劑，可以很好的溶解蛋白質(zhì)并使蛋白結構變得一致，因此本研究采用6 mol/L鹽酸胍作為流動相對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行分離。研究發(fā)現(xiàn)流動相pH在6.5~7.5范圍內(nèi)對于兩種蛋白的分離沒有太大區(qū)別，如圖1，并且避開了α-乳白蛋白4.2左右、β-乳球蛋白5.2左右以及酪蛋白4.8左右的等電點，不會造成樣品中蛋白質(zhì)的沉淀。因此，本標準對于流動相的p H值范圍設定為6.5~7.5。

圖1流動相pH值對于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分離的影響

2.1.3 液相色譜色譜柱的確定

乳清蛋白家族中，對α-乳白蛋白檢測的主要干擾來自于β-乳球蛋白，α-乳白蛋白的相對分子質(zhì)量約為14 000 u，β-乳球蛋白的分子量為18 000 u，兩者的分子量較為接近，需要選取有效的體積排阻色譜柱（SEC柱）對兩者進行分離。本研究嘗試使用一根耐高壓的內(nèi)經(jīng)為1.9μm或者2.7μm，長度為30 cm的體積排阻色譜柱對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白進行分離，結果單根色譜柱均無法對兩種蛋白進行很好的分離，如圖2。由于分子量太接近，一根體積排阻色譜柱無法將這兩種蛋白完全分離，考慮串聯(lián)兩根提價排阻色譜柱來進行分離，由于耐高壓的體積排阻色譜柱成本較高，本研究選取了串聯(lián)兩根內(nèi)徑為5μm，長度為30 cm的體積排阻色譜柱來進行測試。共購買了3個品牌的2根體積排阻色譜柱進行串聯(lián)，分別為TSK-GEL G3000 SWXL（5μm，7.8 mm×300 mm）、Dikma SEC 1000（5μm，7.8×300 mm）以及Thermo的MAbPac SEC-1（5μm，7.8×300 mm）。相對而言，兩根Thermo的MAbPac SEC-1連用對于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況較好，見圖3。

圖2 一根2.7μm以及一根1.9μm體積排阻色譜柱對于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況

圖3不同品牌的兩根凝膠色譜柱串聯(lián)對于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離情況

2.2 方法的線性范圍及檢出限

2.2.1 線性范圍

線性范圍是指試樣量與響應訊號之間保持線性關系的范圍。各取50μL濃度為0、25、50、125、250、500 mg/L的標準曲線溶液，分別按上述色譜條件進行分析。以相應的色譜峰面積y為縱坐標、待測組分的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關系數(shù)。所得結果見表1和圖4。說明待測組分在該濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關系。

表1線性方程

圖5α-乳白蛋白的標準工作曲線

2.2.2 方法的檢出限和定量限

標準曲線最低點為10 mg/L,取50μL標準工作溶液最低點注入超高效液相色譜儀,溶液在相同條件下進樣6次,記錄色譜峰面積,以最低濃度峰與基線噪音峰比值的3倍測得目標物的檢出限(limit of detection,LOD),以最低濃度峰與基線噪音峰比值的10倍測得目標物的定量限(limit of quantitation,LOQ),計算出方法的檢出濃度和定量濃度,測定結果見表2。

表2α-乳白蛋白的檢出濃度和定量濃度

α-乳白蛋白的檢出濃度為3.00μg/mL，定量濃度為10.0μg/mL。當牛奶的取樣量為0.5 g，定容體積為10 m L的時候，檢出限為0.006 g/100 g，定量限為0.02 g/100 g；當乳粉的取樣量為1.0 g，稀釋倍數(shù)為10時，檢出限為0.03 g/100 g，定量限為0.1 g/100 g；當乳清粉的取樣量為1.0 g，稀釋倍數(shù)為20時，檢出限為0.6 g/100 g，定量限為2.0 g/100 g。

2.3 回收率及精密度實驗

選取嬰幼兒配方乳粉、乳清粉、牛乳樣品基質(zhì)，由于樣品本底就會含有α-乳白蛋白，因此乳粉和牛乳的實際加標量，會根據(jù)樣品中本底含量來添加，添加量為本底的一半、本底值以及本底的2倍作為低、中、高3個加標濃度進行回收率實驗，每一個添加水平重復6次。乳清粉通常作為原料添加到配方乳粉中，因此乳清粉中α-乳白蛋白的含量范圍跨度可能較大，根據(jù)實際檢測經(jīng)驗，加標量為（10%、20%、40%），每一個添加水平重復測定6次。按照相同的分析方法進行測定，比較加入標準樣品后實際測得的含量扣除本底值后和理論添加的含量的比值，來計算加標回收率，并計算測定結果的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),牛奶、乳粉和乳清粉中α-乳白蛋白低中高3種濃度的加標平均回收率分別為90.9%～98.2%、100.0%～101.4%和95.1%～100.4%，相對標準偏差范圍分別為1.03%～2.34%、1.84%～5.26%和3.94%～6.06%，詳見表3。

表3不同樣品基質(zhì)中平均回收率及精密度

2.4 實際樣品測定結果

使用本研究建立的方法，對市場上及企業(yè)提供的40批次乳粉，企業(yè)提供的10批次α-乳清粉以及10批次滅菌牛乳進行了α-乳白蛋白的含量的測定，可以看到牛奶中α-乳白蛋白的本底值大概在0.1%左右，乳清粉中α-乳白蛋白的含量大概在30%～40%左右，嬰配粉中可能額外添加α-乳白蛋白，因此含量跨度比較大，有標簽表示值的和檢出值比較接近，具體檢測結果見表4。

表4實際樣品測試結果

（續(xù)表4）

3 結論

本研究建立牛奶、牛乳粉和牛乳清粉中的α-乳白蛋白含量測定的體積排阻色譜法,該方法具有前處理簡單、準確度高等特點。經(jīng)實際樣品檢測證明,該方法適合牛奶、牛乳粉和牛乳清粉中α-乳白蛋白的含量檢測,為企業(yè)保健品注冊以及政府對于乳制品市場的監(jiān)管提供了強有力的技術保障。