盧文燕，楊靜娜，胡明月，黃啟雪，未安琪，王月影，鐘凱，朱河水，韓立強(qiáng)

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州450046）

0 引言

乳脂肪作為乳汁的主要成分，主要以乳脂肪球（milk fat globule，MFG）的形式存在。MFG的大小從0.2μm到15μm不等[1]，其大小受到生理狀態(tài)、環(huán)境等條件影響[2-3]。MFG以甘油三酯核心，外面包裹著脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的膜，稱為乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）。MFGM極性脂質(zhì)主要由甘油磷脂和鞘脂組成，其中鞘脂主要以鞘磷脂形式存在[4]。牛乳中MFG鞘脂含量可能受到動(dòng)物品種、生理、膳食和環(huán)境因素等的影響[5]。飼喂添加亞麻籽日糧的奶牛乳汁SM含量顯著升高[6]。鞘脂也在脂滴發(fā)生中起作用[7]。鞘脂作為MFGM的重要組成部分，是否影響乳脂肪球粒徑目前尚不清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)重力分層分離出不同粒徑的脂肪球，質(zhì)譜分析大、小粒徑脂肪球的鞘脂濃度，為分析脂肪球的粒徑特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲醇、乙腈、異丙醇（色譜純），Merck；甲酸銨、氯仿（色譜純），F(xiàn)isher；尼羅紅（Nile red）、甲酸（色譜純），中國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲基叔丁基醚（色譜純），CNW；脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%），Avanti公司。

1.1.2 儀器

馬爾文3000激光粒度儀，英國(guó)；移液槍、離心機(jī)，Eppendorf德國(guó)；LC-MS/MS（SCIEX，QTRAP 6500+），美國(guó)；X 35倒置熒光顯微鏡，Olympus，日本。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)管理

本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物飼養(yǎng)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場(chǎng)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)所用荷斯坦奶牛在同一雙列式牛舍內(nèi)飼養(yǎng)，隨機(jī)選取體型、身體狀況、產(chǎn)犢頻率和產(chǎn)犢日期相近的泌乳中期的8頭荷斯坦奶牛的乳樣進(jìn)行采樣分析。實(shí)驗(yàn)期間采用全混日糧（Total Mixed Ration，TMR），按照自由采食，自由飲水的方式進(jìn)行飼養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)?zāi)膛＝y(tǒng)一管理。泌乳母牛每天早上6:00，下午15:00和晚上20:00擠奶3次，在6:00和15:00擠奶后飼喂基礎(chǔ)日糧。基礎(chǔ)日糧由玉米青貯和苜蓿甘草組成。

1.2.2 乳脂肪球的重力分層

參考Mesilati-StahyR等人的方法[8]，將采取的乳樣樣品分別混合，轉(zhuǎn)移到60 mL注射器中。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。注射器針頭取下，并用封口膜密封，防止液體流出，室溫下靜置24 h，乳樣可因重力因素分為六層和最上層的奶油層。24 h后，輕輕取下封口膜，使乳樣液體從針孔流出，約每10 mL乳樣收集于一個(gè)離心管中，從下至上分別命名為F1至F6，最上層奶油層為F7。用馬爾文3000激光粒度儀分別測(cè)量每層組分的乳脂肪球粒徑大小，獲得粒徑D[3,2]、D[4,3]、Dv（10）、Dv（50）、Dv（90）、SSA的值。取F1和F7層的牛奶樣品進(jìn)行尼羅河紅染色和鞘磷脂含量分析。

1.2.3 F1和F7層乳脂肪球尼龍紅染色鑒定

參考張宇[9]、黃啟雪[10]等人的方法，將F1和F7層脂肪球樣品進(jìn)行尼羅紅染色。首先將F1和F7層脂肪球樣品分別進(jìn)行混勻稀釋，加入1 mL尼羅紅染料（質(zhì)量濃度100μg/mL），混勻后避光染色20 min，取適量染色后的樣品與瓊脂糖（質(zhì)量濃度5 g/L）等量混合，隨后將混合物滴到至載玻片上，避光放置待樣品凝固后，采用倒置熒光顯微鏡在500~650 nm波長(zhǎng)出激發(fā)尼羅紅熒光探針，觀察脂肪球的形狀和大小。

1.2.4 鞘磷脂含量分析

1.2.4.1 磷脂樣品的提取

從-80℃冰箱中取出樣本放在裝有冰的離心管盒里解凍；樣本解凍后，渦旋混勻10 s左右，離心5 min，4℃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min；取樣本50μL加入到對(duì)應(yīng)的離心管中，加入1 mL脂質(zhì)提取液（甲基叔丁基醚∶甲醇=3∶1，體積比，含內(nèi)標(biāo)混合液）；渦旋2 min，超聲5 min，加入200μL水；渦旋1 min，轉(zhuǎn)速12 000 r/min、4℃條件下離心10 min；離心完后吸取上清液500μL到離心管中，濃縮；用200μL流動(dòng)相B復(fù)溶，用于LCMS/MS分析。

1.2.4.2 色譜質(zhì)譜條件

樣品分析采用島津LC-30A超高液相色譜系統(tǒng)與AB Sciex三重TOF高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀耦合進(jìn)行。色譜柱：Thermo AccucoreTMC30柱(2.6μm,2.1 mm×100 mm i.d.)；流動(dòng)相：A相，乙腈/水（60∶40，體積比）（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸，濃度10 mmol/L甲酸銨）；B相，乙腈/異丙醇（10/90，體積比）（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，濃度10 mmol/L甲酸銨）；梯度洗脫程序：0 min為A/B為80∶20（體積比），2 min為70∶30（體積比），4 min為40∶60（體積比），9 min為15∶85（體積比），14 min為10∶90（體積比），15.5 min為5∶95（體積比），17.3 min為5∶95（體積比），17.5 min為80∶20（體積比），20 min為80∶20（體積比）；流速0.35 m L/min；柱溫45℃；進(jìn)樣量2μL。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）溫度500℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓-4 500 V，離子源gas 1（GS1）310.27 k Pa，gas 2（GS2）379.225 k Pa，簾氣（Curtain Gas,CUR）241.325 k Pa。在三重四極桿中，每個(gè)離子對(duì)是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（Declustering Potential，DP）和碰撞能（Collision Energy，CE）進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One way ANOVE）比較乳脂肪球粒徑，T-Test分析F1和F7層鞘磷脂的含量差異，以P＞0.05表示差異不顯著，*P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 重力分層對(duì)乳脂肪球粒徑的影響

圖1中，(A)D[3,2];(B)D[4,3];(C)Dv(10);(D)Dv(50);(E)Dv(90);(F)SSA。a-f：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P＜0.05）。D[3,2]：表面積相關(guān)等效直徑；D[4,3]：體積相關(guān)的等效直徑；Dv(10):10%的粒子的體積徑;Dv(50):50%的粒子的體積徑；Dv(90):90%的粒子的體積徑；SSA:比表面積。

由圖1可以看出，經(jīng)過(guò)重力分層后，F(xiàn)1-F7層之間的粒徑存在明顯差異。D[3,2]在F1層是2.25μm，F(xiàn)4層是2.71μm，F(xiàn)7層是3.97μm（P＜0.05）；D[4,3]在F1層是2.37μm，F(xiàn)4層是3.09μm，F(xiàn)7層是4.16μm（P＜0.05）；其他的粒徑參數(shù)Dv(10)、Dv(50)和Dv(90)也從F1到F7層逐漸增加。而比表面積（SSA）則呈現(xiàn)出逐漸減小的變化，在F1層是2666.67 m2/kg、F4層是2214 m2/kg，F(xiàn)7層是1510.33 m2/kg（P＜0.05）。從這些結(jié)果可以看出F1層粒徑最小，F(xiàn)7層粒徑最大，并且與F7層相比，小粒徑的F1具有更大的表面積（P＜0.05）。

圖1 不同重力分層牛乳的脂肪球粒徑參數(shù)

2.2 乳脂肪球尼龍紅染色鑒定

為了進(jìn)一步確定重力分層對(duì)乳脂肪球粒徑大小的影響，用染色的方法對(duì)F1層和F7層的乳脂肪球進(jìn)行鑒定。由圖2可以看出乳中脂肪球因具有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)能被尼羅紅標(biāo)記，在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)大小不一的橘黃色球狀。觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)7層中出現(xiàn)比例較多的大脂肪球，F(xiàn)1層中出現(xiàn)較多的小脂肪球，進(jìn)一步證明采用重力分層的得到的F1層是小粒徑脂肪球，F(xiàn)7層是大粒徑脂肪球。

圖2 F1和F7層的乳脂球染色

2.3 乳脂肪球的鞘脂含量分析

實(shí)驗(yàn)選取粒徑有顯著差異的F1層和F7層乳脂肪球進(jìn)行鞘脂的質(zhì)譜分析，共鑒定到28種鞘磷脂、5種神經(jīng)酰胺、2種鞘氨醇和12種糖鞘脂(圖3和圖4)，其中在乳中含量最高的SM（d41:1）45.90 nmol/L，含量最低的SM（d32:2）0.066 nmol/L。與F1層相比，F(xiàn)7層的23種SM化合物SM（d30:0）、SM（d32:0）、SM（d34:0）、SM（d36:0）、SM（d38:0）、SM（d40:0）、SM（d30:1）、SM（d32:1）、SM（d33:1）、SM（d34:1）、SM（d35:1）、SM（d36:1）、SM(d37:1)、SM（d40:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）、SM（d43:1）、SM（d44:1）、SM（d32:2）、SM（d34:2）、SM（d36:2）、SM（d40:2）、SM（d42:2）均有顯著升高（P＜0.05），如F1層SM（d34:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）含量分別為4.56 nmol/L、6.22 nmol/L、3.62 nmol/L；而F7層SM（d34:1）、SM（d41:1）、SM（d42:1）含量分別為26.37 nmol/L、45.90 nmol/L、24.77 nmol/L。4種Cer化合物Cer（d16:1/24:0）、Cer（d18:1/26:1）、Cer（d18:1/24:1）、Cer（d18:1/24:0）在F7與F1層之間相比顯著增加，糖鞘脂HexCer（d18:1/24:0）和鞘氨醇也SPH（d16:1）也顯著增加（P＜0.05）。圖3中，SM為鞘磷脂。圖4中，HexCer為糖鞘脂；Cer為神經(jīng)酰胺；SPH為鞘氨醇。

圖3 F1層、F7層中SM化合物含量的分析

圖4 F1層、F7層中神經(jīng)酰胺、糖鞘脂和鞘氨醇含量的分析

3 討論

本研究對(duì)8頭泌乳期的荷斯坦奶牛乳樣采集，將新鮮牛奶通過(guò)重力分層為F1-F7層，檢測(cè)不同大小脂肪球中鞘脂含量，發(fā)現(xiàn)與F1層小粒徑脂肪球相比，F(xiàn)7層大粒徑脂肪球的鞘脂化合物含量有顯著升高（P＜0.05）。

在本研究中通過(guò)重力分層發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)7層脂肪球粒徑最大，F(xiàn)1層脂肪球粒徑最小。一般來(lái)說(shuō)，脂肪球上升速度與顆粒直徑的平方成正比。大脂肪球由于直徑大，在牛乳中的上升速度比小脂肪球快速。本實(shí)驗(yàn)把牛奶放置24 h后收集各部分（F1至F7），大脂肪球已移至頂部，所以F7層脂肪球粒徑最大，F(xiàn)1層脂肪球粒徑最小。重力分離會(huì)使乳脂肪在分離柱中重新分布，放置的時(shí)間越長(zhǎng)，大粒徑的脂肪球會(huì)集中在上層[11]。在本研究中，粒徑檢測(cè)的結(jié)果和染色圖也與此相符，從F1至F7層的粒徑逐漸增大。對(duì)于比表面積（SSA）來(lái)說(shuō)，越小粒徑的脂肪球，其比表面積越大[12]。在本研究中結(jié)果與此類似，隨著F1-F7層粒徑的增大，SSA的數(shù)值逐漸減小。

牛奶中的鞘脂主要來(lái)源于乳脂球膜，是乳脂球膜的重要組成部分，對(duì)于維持乳脂球膜的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[13]。鞘脂是一種以鞘氨醇為基本骨架的復(fù)雜脂類，主要分為鞘氨醇類、神經(jīng)酰胺類、鞘磷脂類、鞘糖脂等，它們根據(jù)在烷基鏈長(zhǎng)度和分支、雙鍵的數(shù)量和位置、1-位羥基取代集團(tuán)等不同可分為SM（d14:1）、SM（d34:0）、SPH（d16:1）、Cer（d16:1/24:0）等[14]。其中神經(jīng)酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂不僅促進(jìn)嬰兒神經(jīng)發(fā)育，還被證明在調(diào)節(jié)中性脂質(zhì)合成或降解具有重要作用[15-16]。孫明謙等在小鼠肝臟發(fā)現(xiàn)21種鞘脂，其中神經(jīng)酰胺可以影響糖脂代謝[17]。給奶牛飼喂葵花籽發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)調(diào)控乳腺鞘脂合成酶的表達(dá)影響乳脂中鞘脂的含量[18]。徐慧發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺類鞘脂均能顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，并且對(duì)脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PPARγ表達(dá)具有顯著的抑制作用[19]。本研究通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)不同粒徑大小脂肪球的鞘脂相關(guān)含量具有明顯差異，脂肪球粒徑越大，鞘磷脂和神經(jīng)酰胺的含量越大，因此可以推測(cè)乳脂肪球膜的鞘脂受到脂肪球粒徑的影響。

4 結(jié) 論

本研究采集泌乳期的荷斯坦奶牛乳樣，通過(guò)重力分層的方法分為大粒徑脂肪球和小粒徑脂肪球，分析發(fā)現(xiàn)在大粒徑的脂肪球中鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等鞘脂含量比小粒徑脂肪球顯著升高，說(shuō)明脂肪球粒徑大小影響了乳脂肪球的鞘脂含量，這一結(jié)果為更好地理解MFG的形成機(jī)理，生產(chǎn)具有高鞘脂含量乳制品打下基礎(chǔ)。