連超杰

中國(guó)食品藥品檢定研究院

康帥*

中國(guó)食品藥品檢定研究院

張南平

中國(guó)食品藥品檢定研究院

鄭健

中國(guó)食品藥品檢定研究院

馬雙成*

中國(guó)食品藥品檢定研究院

種子類藥材系指使用植物的種子、種仁、假種皮作為藥用部位的藥材[1]。全草類、花類、果實(shí)類藥材中也大多含有種子，部分單心皮果實(shí)類藥材如火麻仁在性狀上與種子類藥材相近。由于種子普遍較小，不同種子相似程度高，種子的性狀檢驗(yàn)一直是中藥民族藥監(jiān)管工作中的難點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外種子鑒別研究取得了一定的成果[2]，但缺少對(duì)種子類藥材藥品標(biāo)準(zhǔn)性狀項(xiàng)文本的統(tǒng)計(jì)分析。本文研究對(duì)《中國(guó)藥典》2020年版一部收載的499 種植物藥材中47 個(gè)以種子、種仁為藥用部位的種子類藥材進(jìn)行了性狀項(xiàng)大小描述文本的統(tǒng)計(jì)分析和實(shí)例研究，擬為種子類中藥材的日常監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 種子類藥材標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)分析

1.1 種子類藥材標(biāo)準(zhǔn)的納入與排除

本文統(tǒng)計(jì)分析的目的是歸納種子類藥材標(biāo)準(zhǔn)性狀描述的整體情況，因此，收集時(shí)主要納入以描述種子為主的藥材標(biāo)準(zhǔn)文本，包括：①部位為植物學(xué)定義上的種子（seed）的藥材標(biāo)準(zhǔn)；②部位為植物學(xué)定義上的種子一部分的藥材標(biāo)準(zhǔn)，包含種子團(tuán)、種仁、胚乳、茸毛等，如大風(fēng)子仁。

標(biāo)準(zhǔn)文本的主要性狀描述不是種子的應(yīng)排除，包括：①部位為含有種子的果實(shí)、花、全草的藥材標(biāo)準(zhǔn)，如部位為閉果的藥材標(biāo)準(zhǔn)，如紫蘇子、牛蒡子，其很難分清種皮和果皮。②部位的原料為種子，但形態(tài)改變較大的，包括脂肪油類、粉末、霜類、發(fā)芽類、發(fā)酵類、加工類，如巴豆霜、大豆黃卷、淡豆豉等。③為了性狀統(tǒng)計(jì)的一致性，暫不收錄假種皮為部位的藥材標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 《中國(guó)藥典》種子類藥材的名錄

標(biāo)準(zhǔn)文本的出處主要包括《中國(guó)藥典》2020年版。多基原種子類藥材，每個(gè)基原分開(kāi)統(tǒng)計(jì)。根據(jù)以上原則可得出，47 個(gè)種子類藥材品種覆蓋了33 個(gè)科63 個(gè)基原，詳見(jiàn)表1。

表1 種子類藥材標(biāo)準(zhǔn)名錄

1.3 《中國(guó)藥典》2020年版種子類藥材標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)

63 個(gè)種子類藥材基原中，藥用部位為“干燥成熟種子”有59個(gè)，占總數(shù)的94%；3 個(gè)“干燥成熟種仁”，占5%；1 個(gè)“干燥近成熟種子”，占1%。本研究統(tǒng)計(jì)按照《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)工作手冊(cè)》（第四版）國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥）正文各論編寫細(xì)則的要求，對(duì)《中國(guó)藥典》2020年版中的47 個(gè)種子類藥材63 個(gè)基原的大小進(jìn)行了長(zhǎng)度、寬度（含直徑）、厚度的數(shù)據(jù)拆分并計(jì)算均數(shù)，對(duì)每個(gè)數(shù)值的藥材基原進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到了《中國(guó)藥典》2020年版收載種子類大小的總體分布數(shù)據(jù)，結(jié)果詳見(jiàn)表2。同時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)文本中的長(zhǎng)寬數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)了各種子類藥材的種形指數(shù)。種形指數(shù)（長(zhǎng)寬比）是種子檢驗(yàn)中常用的比較穩(wěn)定的性狀特征，在瓜蔞子[3]、何首烏種子[4-5]、山茱萸種子[6]的研究中得到了較好的應(yīng)用。本研究統(tǒng)計(jì)種形指數(shù)及其偏差的計(jì)算結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表2 《中國(guó)藥典》2020年版收載種子類藥材性狀文本中的長(zhǎng)度、寬度、厚度分布的統(tǒng)計(jì)表

續(xù)表

表3 基于《中國(guó)藥典》2020年版收載種子類藥材性狀文本數(shù)據(jù)中種形指數(shù)的統(tǒng)計(jì)

續(xù)表

續(xù)表

2 青葙子、雞冠花子的鑒別研究實(shí)例

青葙子、雞冠花子均為細(xì)小種子，形態(tài)極為相似。目前鑒別方法的研究集中在性狀、顯微結(jié)構(gòu)等方面。其中，性狀鑒別方法由于其快速、簡(jiǎn)便應(yīng)用較多，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道集中在藥材形狀、種臍形狀兩個(gè)特征[7]，也有利用藥材上殘留花柱的方法進(jìn)行鑒別[8]。但是性狀鑒別方法也存在一定的問(wèn)題：如對(duì)種臍偏向一側(cè)的程度、扁圓形和腎形的判斷存在主觀差異，殘留花柱不易找到等。顯微結(jié)構(gòu)鑒別方法特點(diǎn)快速且特征更加穩(wěn)定，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道集中在種皮表皮細(xì)胞、種皮內(nèi)層細(xì)胞、胚乳細(xì)胞等的比較、種子形狀、種臍、種皮紋理的微形態(tài)比較[9-13]。現(xiàn)有顯微結(jié)構(gòu)鑒別方法也存在一定的問(wèn)題，如種子橫切難度大，外表皮較厚透光差；種子表面紋理間的區(qū)別主觀性大等。其他的鑒別方法還有傅立葉變換紅外吸收光譜[14-15]、導(dǎo)數(shù)光譜[16]、ITS2序列鑒別[17]、蛋白電泳[18]、差熱分析法[19]、氨基酸和無(wú)機(jī)元素含量分析[20]、脂肪酸類成份比較等[21]。

因此，本文以青葙子、雞冠花子為例嘗試使用統(tǒng)計(jì)結(jié)論開(kāi)展進(jìn)一步鑒別研究。

2.1 樣品

本研究共收集青葙子（莧科植物青葙Celosia argenteaL. 的干燥成熟種子）3 批，以及雞冠花子（莧科植物雞冠花Celosia cristataL. 的干燥成熟種子）3 批。樣品由中國(guó)食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定，并保存與中國(guó)食品藥品檢定研究院中藥所標(biāo)本館。

2.2 儀器

ZEISS Axio Zoom.V16 德國(guó)蔡司公司體式熒光變倍顯微鏡，Phenom Pure plus 美國(guó)飛納公司掃描電子顯微鏡。

2.3 方法

2.3.1 微性狀方法

前處理：直接觀察或沿與種臍平行的軸橫切后用雙面膠固定觀察。在體式顯微鏡下，分別使用12 倍和80 倍在明場(chǎng)白光、藍(lán)光激發(fā)綠色熒光、黃光激發(fā)紅色熒光、紫外光激發(fā)藍(lán)色熒光四個(gè)光采集通道觀察。圖像處理采用在Z軸方向連續(xù)拍攝不同對(duì)焦面的照片，用景深擴(kuò)展方法對(duì)獲得的特征照片進(jìn)行合成，獲得清晰的特征圖像。

2.3.2 微形態(tài)方法

前處理：樣品經(jīng)50%乙醇超聲清洗1 min，干燥后用導(dǎo)電雙面膠固定，離子濺射真空鍍金后觀察。觀察方法：使用SE 或BSE成像模式，高真空條件，加速電壓15 kV，標(biāo)準(zhǔn)束流強(qiáng)度，拍攝不同放大倍數(shù)下的種子特征照片。

2.4 結(jié)果

2.4.1 青葙子與雞冠花子的微性狀

青葙子常為扁圓形，少數(shù)呈圓形或腎形，直徑1.0～1.5mm；雞冠花子扁圓形或腎形，表面常凹陷，直徑1.0～1.8mm，體式鏡下易于觀察（圖1、圖2）。

圖1 青葙子 （12 倍物鏡下）

圖2 雞冠花子（12 倍物鏡下）

青葙子種臍呈果柄形，少數(shù)略偏向一側(cè)；雞冠花子種臍呈鳥(niǎo)喙形，偏向一側(cè)，體式鏡下易于觀察（圖3、圖4）。種臍正面觀時(shí)，青葙子種孔常在種臍側(cè)面或被種臍遮擋；雞冠花子種孔常位于正面，體式鏡下可觀察（圖5、圖6），電子顯微鏡下易于觀察（圖7-10）。

圖3 青葙子及其種臍 （80 倍物鏡下）

圖4 雞冠花子及其種臍（80 倍物鏡下）

圖5 青葙子種臍正面觀（80 倍物鏡下）

圖6 雞冠花子種臍正面觀（80 倍物鏡下）

圖7 青葙子種臍1000 倍（電鏡采集）

圖8 雞冠花子種臍1000 倍（電鏡采集）

圖9 青葙子種臍正面觀 800 倍（電鏡采集）

圖10 雞冠花子種臍正面觀800倍（電鏡采集）

2.4.2 青葙子與雞冠花子在橫切面上的異同

在明場(chǎng)通道下，青葙子和雞冠花子的橫切面中間均為淺色近透明的胚乳，兩端為白色的胚。青葙子橫切面中間隆起明顯，隆起處種皮增厚（20～35μm）。雞冠花子中間隆起不明顯，呈弓形，隆起處種皮不增厚（16～30μm）。在DS-RED、 GFPNB 和UV 熒光通道下，青葙子和雞冠花子的胚乳幾乎不發(fā)出熒光，胚均受激發(fā)出熒光（圖11、圖12），電子顯微鏡下均易觀察（圖13、圖14）。

圖11 青葙子橫切面 80 倍（明場(chǎng)、三種熒光通道采集）

圖12 雞冠花子橫切面 80 倍（明場(chǎng)、三種熒光通道采集）

圖13 青葙子橫切面 300 倍（電鏡采集）

圖14 雞冠花子橫切面 300 倍（電鏡采集）

2.5 結(jié)論與討論

青葙子和雞冠花子在整體形狀大小、種臍形狀、種孔位置、橫切面上有較為明顯的區(qū)別。青葙子圓形或扁圓形，少數(shù)腎形，直徑1.0～1.5mm，種臍果柄形，多數(shù)不偏向一側(cè)；種孔常位于種臍側(cè)面或?yàn)榉N臍遮擋；從橫切面觀察，其中部隆起明顯，隆起處種皮較厚。雞冠花子扁圓形或腎形，表面常凹陷，直徑1.0～1.8mm，種臍鳥(niǎo)喙形，偏向一側(cè)；種孔明顯；從橫切面觀察，中間隆起不明顯，橫切面呈弓形，隆起處種皮不增厚。詳見(jiàn)表5。

表5 青葙子和雞冠花子性狀、顯微特征區(qū)別表

3 監(jiān)管建議

從長(zhǎng)度、寬度、厚度的數(shù)據(jù)范圍來(lái)看，超過(guò)50%的種子長(zhǎng)度、寬度（直徑）、厚度都集中在1cm 以下，部分?jǐn)?shù)據(jù)精度達(dá)到0.01cm（0.1mm）。普通解剖鏡難以達(dá)到此精度要求，建議在監(jiān)管中推廣使用體式顯微鏡，甚至電鏡等儀器進(jìn)行觀察、測(cè)量。同時(shí)，還需進(jìn)一步加強(qiáng)表面特征的觀察總結(jié)。例如，青葙子的表面網(wǎng)格狀紋理是其穩(wěn)定的特征，已收入《新編中藥志》和《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，在《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)提升中建議考慮。

通過(guò)本次統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，大部分《中國(guó)藥典》收載品種都可以計(jì)算種形指數(shù)，且可通過(guò)種形指數(shù)的偏差，數(shù)量化的描述反映種子的形狀。特別是多基原品種更需要通過(guò)種形指數(shù)特征進(jìn)行鑒別。例如，瓜蔞子的兩個(gè)基原中雙邊栝樓種子長(zhǎng)、寬兩個(gè)邊界值分別得到的兩個(gè)種形指數(shù)為1.88、1.90，偏差為1.32%，而栝樓種子的兩個(gè)種形指數(shù)2.00、1.50，偏差為28.57%，數(shù)量化的描述了兩者形狀的差別。但是，部分種子缺少長(zhǎng)、寬數(shù)值，無(wú)法通過(guò)種形指數(shù)反映種子形狀上的穩(wěn)定特征，例如，青葙子僅有直徑（寬）值，而青葙子的長(zhǎng)寬比是青葙屬與同科莧屬的重要區(qū)別點(diǎn)。對(duì)于多基原種子類藥材和種形指數(shù)是其植物分類學(xué)重要鑒定特征的種子類藥材來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)、寬、厚數(shù)值是值得測(cè)量和總結(jié)的，建議在藥品監(jiān)管工作中特別是標(biāo)準(zhǔn)制修訂時(shí)予以重視。