閻華，劉宇陽，陳永嚴，肖紅，劉宏毅

膠質瘤起源于神經(jīng)上皮組織，約占原發(fā)腦腫瘤的45.2%[1]，惡性腦腫瘤的80%[2]。膠質瘤侵襲性極高，在腦內沿白質纖維呈三維不規(guī)則浸潤生長，甚至可在有限范圍內見到多中心生長。目前國內采用的膠質瘤的主流治療方案由Stupp教授在2005年提出，包括安全前提下最大程度地切除腫瘤，隨后6周的同步放化療及6周期的替莫唑胺(temozolomide，TMZ)輔助化療[3]。即使如此，膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)患者的中位生存期也僅僅14.6個月[4]。

由于腦組織的特殊性限制了手術的切除范圍，侵犯至周邊組織的膠質瘤細胞將成為點燃復發(fā)的火種，因此探尋膠質瘤局部浸潤侵襲機制，對患者治療有著重大意義。在本研究的前期工作中，篩選出磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)可能參與了膠質瘤的惡性生物學行為，體現(xiàn)在高級別、易復發(fā)、放射抵抗的膠質瘤中表達明顯升高[5-6]，提示在膠質瘤中PGK1可能與促進膠質瘤細胞侵襲浸潤相關。為此，本研究設計了一系列實驗，探尋PGK1對膠質瘤侵襲生長的影響極其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 U87細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)，胎牛血清(GIBCO)，完全培養(yǎng)基(HyClone)，細胞裂解液(碧云天)，PMSF(碧云天)，PVDF膜(Millipore公司)，PGK1一抗(novus，1∶1 000)，β-catenin一抗(Affinity，1∶800)，p-β-catenin(S552)一抗(Affinity，1∶1 000)，p-β-catenin(Y142)一抗(abcam，1∶500)，p-β-catenin(Y333)一抗(abcam，1∶1 000)，p-β-catenin(Y654)一抗(abcam，1∶1 000)，p-β-catenin(S675)一抗(Affinity，1∶2 000)，GADPH(杭州賢至生物有限公司，1∶1 000)，羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，1∶100)，抗熒光淬滅劑封片液(southernbiotech公司)Human PGK1 cDNA質粒(北京義翹神州科技有限公司，HG11114-M)，BamH I及Not I(TAKARA)，Trizol試劑(Ambion公司)，martigel(BD公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen公司)，β-catenin抑制劑(XAV 939)(targetmol公司)。

1.2 PGK1，β-catenin表達情況檢測 U87細胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。PBS(0.01 M pH 7.2～7.3)洗滌細胞，重復以上操作兩次。以含PMSF的裂解液(按1 mL裂解液加10 μL PMSF)冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 rpm離心5 min。將離心后的上清分裝轉移到0.5 mL的離心管。將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液放入沸水中進行沸水浴10 min，變性完后冷卻至室溫。將制備好的膠固定到電泳槽上，儲液池中倒入電泳液。用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和marker(北京全式金生物技術有限公司，DM111)加入上樣孔，各樣品總蛋白量為40 μg。在12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2 h，濕法轉移蛋白質到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜封閉2 h。用封閉液稀釋一抗，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。用封閉液稀釋相應的HRP標記二抗(1∶5 000稀釋)，孵育2 h。重復洗膜過程?；瘜W發(fā)光法檢測并暗室曝光，X膠片顯影。以β-actin為內參，將目的蛋白條帶灰度與內參進行比較，獲得比值，定量蛋白表達程度。

1.3 細胞生長、遷移及侵襲能力檢測

1.3.1 CCK-8檢測細胞增殖 按分組進行細胞轉染和藥物處理72 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h；酶標儀測定各孔吸光值光密度(optical delnsity，OD)450。

1.3.2 Transwell-martigel檢測細胞侵襲 消化細胞，按2.5×104cell/mL濃度接種在含martigel的Tranwell小室上室，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，按分組進行細胞轉染和藥物處理；轉染72 h后取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干凈的棉球將上室一側的未遷移細胞擦干凈，用10%甲醇溶液固定細胞30 min；小心切下膜，在膜上滴一滴5%結晶紫染液，室溫中放置20 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 Transwell檢測細胞遷移能力 消化細胞，按2.5×104cell/mL濃度接種在含不含martigel的Tranwell小室上室，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，按分組進行細胞轉染和藥物處理；轉染72 h后取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干凈的棉球將上室一側的未遷移的細胞擦干凈，用10%甲醇溶液固定細胞30 min；小心切下膜，在膜上滴一滴5%結晶紫染液，室溫中放置20 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.4 免疫熒光雙標檢測 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3 min×3次，4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3 min×3次，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加稀釋好的PGK1(1∶50)并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBS浸洗爬片3 min× 3次，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光(FITC)標記羊抗小鼠IgG(1∶100)，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3 min×3次，吸水紙吸干液體，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，然后滴加稀釋好的β-catenin(1∶200)，于4 ℃濕盒中避光孵育過夜。PBS 浸洗爬片3 min× 3次，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光(Cy3)標記羊抗兔IgG(1∶100)，濕盒中37 ℃孵育1 h，PBS浸洗切片3 min× 3次，滴加 DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用抗熒光淬滅劑封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.5 PGK1過表達載體構建、效果驗證及PGK1 siRNA合成、效果驗證

1.5.1 PGK1過表達載體的建立 以NM_000291.3基因序列為模板設計引物，Human PGK1 cDNA質粒為模版擴PCR得到目的片段。用BamH I和Not I雙酶切質粒pLVX-PGK-Puro和膠回收產(chǎn)物homo PGK1。將回收純化的目的片段Homo PGK1與回收純化的載體pLVX-PGK-Puro連接，連接產(chǎn)物命名為pLVX-PGK-Puro-homo-PGK1。連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB AMP平板，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。挑取單個菌落，接種于LB AMP液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 rpm培養(yǎng)過夜。取相應菌液做菌落PCR，送鑒定正確菌液測序。

1.5.2 PGK1 siRNA合成及細胞轉染 設計合成針對人源PGK1的siRNA序列3條及1條對照siRNA。PGK1 siRNA1-Sense(5′-CCAAGUCGGUAG-UCCUUAUTT-3′)，PGK1 siRNA1-Antisense(5′-AUA-AGGACUACCGACUUGGTT-3′)，PGK1 siRNA2-Sense(5′-GCUUCUGGGAACAAGGUUATT-3′)，PGK1 siRNA2-Antisense(5′-UAACCUUGUUCCCAGAAGCTT-3′)，PGK1 siRNA3-Sense(5′-CCUGGAAGGUAAAGUCCU-UTT-3′)，PGK1 siRNA3-Antisense(5′-AAGGACUUU-ACCUUCCAGGTT-3′),Control siRNA-Sense(5′-UUC-UCCGAACGUGUCACGUTT-3′)，Control siRNA-Antisense(5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′)。

取生長狀態(tài)良好的U87細胞，以5×105/孔接種到六孔板中，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱24 h。待細胞貼壁后，按照Lipofectamine 2000試劑盒的轉染步驟準備轉染試劑：一只EP管(A管)用250 μL Opti-MEM稀釋5 μL Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min；一只EP管(B管)用250 μL Opti-MEM(Gibco)稀釋2 μL siRNA或2 μg質粒。將A、B兩管的溶液輕輕混勻后，室溫靜置20 min；將Lipofectamine 2000混合液加入到含有1.5 mL 完全培養(yǎng)基的6孔板中。轉染4～6 h后更換培養(yǎng)基，轉染60 h時加入5 μM XAV 939，再培養(yǎng)12 h。

1.6 qRT-PCR檢測 收集細胞，加入Trizol試劑，用槍吹打混勻，移至無RNase的EP管中，裂解10 min。加入200 μL氯仿，劇烈顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5 min。在4 ℃，12 000 rpm下離心15 min，可見分成上(RNA)/中(蛋白)/下(DNA)三相。轉移上層水相于另一新EP管中，加入異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4 ℃，12 000 rpm，離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入無RNase的75%乙醇，渦旋混勻后，4 ℃，10 000 rpm，離心5 min，重復此步驟一次。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀5～10 min，將沉淀溶于DEPC水中。取溶解后的RNA用微量分光光度計測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度。根據(jù)OD260/OD280比值，估測RNA質量，比值在1.8～2.0之間滿足實驗要求。配制逆轉錄反應體系，逆轉錄成cDNA，25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min。cDNA做8倍稀釋，配制實時熒光定量PCR反應體系，50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles。引物由擎科生物技術公司合成：Homo PGK1-Forward(5′-ACGCCAAGACGTTCAAGCGCAGCTA-3′)，Homo PGK1-Reverse(5′-GGGGAGCGTGCCACCTTGACG-AAGC-3′)，Homo GAPDH-Forward(5′-TGCGCC-CCAGTGTTTAGACTATC-3′)，Homo GAPDH-Reverse(5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′)。

2 結 果

轉染siRNA序列后對U87細胞中PGK1的表達有抑制作用，PGK1過表達載體可增加膠質瘤細胞中PGK1表達量。PGK1過表達載體測序比對達到100%，且經(jīng)PCR驗證顯示高表達PGK1 mRNA，說明載體構建成功。設計合成的3個PGK1 siRNA轉染后，均低表達PGK1 mRNA，選擇干擾效果最好的PGK1 siRNA1進行后續(xù)實驗(siRNA抑制PGK1表達數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析，過表達載體增加PGK1表達數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用t檢驗)。見圖1。

PGK1過表達載體構建成功，PGK1表達量增加，PGK1 siRNA合成成功，U87細胞中PGK1表達受到抑制； A：測序結果； B：PGK1 siRNA轉染后抑制PGK1表達；**表示P<0.01 vs. Control siRNA，誤差線表示SD(Blank表示U87細胞未經(jīng)過任何處理，Control siRNA表示轉染空白siRNA，PGK1 siRNA表示轉染PGK1 siRNA)； C：PGK1過表達載體轉染后高表達PGK1；**表示P<0.01 vs. Control，誤差線表示SD(Control表示轉染空白載體，PGK1 OE表示轉染PGK1過表達載體)

PGK1表達增加可導致U87細胞活性增加，侵襲能力及遷移能力增加；PGK1表達抑制可導致U87細胞活性減弱，侵襲能力及遷移減少。PGK1可對β-catenin表達進行調控。通過前期構建的PGK1過表達載體和PGK1 siRNA進行U87細胞轉染，結果顯示經(jīng)過PGK1 siRNA或PGK1過表達質粒轉染后，U87細胞生長活性出現(xiàn)相應降低及增加，使用β-catenin抑制劑(XAV 939)處理細胞，細胞生長活性降低，并且可導致過表達PGK1的U87細胞生長活性下降(圖2)，細胞侵襲能力和遷移細胞數(shù)也出現(xiàn)相應增加或減少(圖3-4)。

與對照組相比，轉染了siRNA的U87細胞細胞活性均下降，轉染PGK1質粒高表達PGK1的U87細胞活性明顯增高；進一步在高表達PGK1的U87細胞基礎上，使用β-catenin抑制劑XAV 939能一定程度上降低PGK1對細胞增殖活性的影響；數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析，誤差線表示SD；**表示P<0.01

與對照組相比，U87細胞Transwell上室細胞侵襲數(shù)統(tǒng)計結果(5%結晶紫染色，×200)；細胞侵襲能力隨著PGK1表達量的增減出現(xiàn)相應增加或減少，XAV 939抑制β-catenin表達可削弱PGK1對細胞侵襲能力的影響；數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析，誤差線表示SD；**表示P<0.01

與對照組相比，U87細胞Transwell上室細胞遷移數(shù)統(tǒng)計結果(5%結晶紫染色，×200)；隨著PGK1表達量的增減，細胞遷移細胞數(shù)也出現(xiàn)相應增加或減少，β-catenin抑制劑XAV 939可削弱PGK1對U87細胞遷移能力的影響；數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用單因素方差分析，誤差線表示SD；**表示P<0.01

熒光雙染結果顯示，PGK1干擾處理后，細胞PGK1和β-catenin熒光表達均明顯降低，共定位區(qū)域減少；過表達PGK1后，細胞PGK1和β-catenin熒光表達均明顯增加，共定位區(qū)域增加。β-catenin抑制劑(XAV 939)對上游蛋白質PGK1熒光表達無明顯影響，對β-catenin有明顯的抑制作用，PGK1和β-catenin共定位區(qū)域減少(圖5)。

圖5 PGK1與β-catenin在U87細胞中表達的熒光雙染檢測

Western Blot檢測顯示，PGK1干擾處理后，細胞PGK1、β-catenin、p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)蛋白質表達均明顯降低；過表達PGK1后，各蛋白質表達均明顯增加。β-catenin抑制劑(XAV 939)對上游蛋白質PGK1表達無明顯影響，對β-catenin、p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)的表達均有明顯的抑制效果(圖6)。

Control siRNA表示U87細胞經(jīng)過空白siRNA轉染72 h；PGK1 siRNA表示U87細胞經(jīng)過PGK1 siRNA轉染72 h；Vector NC表示U87細胞經(jīng)過空白質粒轉染72 h；PGK1 OE表示U87細胞經(jīng)過PGK1過表達質粒轉染72 h；Vector NC+XAV 939表示U87細胞經(jīng)過空白質粒轉染60 h后，加入5 μM β-catenin抑制劑(XAV 939)處理12 h；PGK1 OE+XAV 939表示U87細胞經(jīng)過PGK1過表達質粒轉染60 h后，加入5 μM β-catenin抑制劑(XAV 939)處理12 h

p-β-catenin(S675)磷酸化位點為Ser675，磷酸化后可促進β-catenin與轉錄因子結合，p-β-catenin(S552)磷酸化位點Ser552，p-β-catenin(Y142)磷酸化位點為Tyr142，兩者參與破壞細胞間粘附及連接；p-β-catenin(Y333)磷酸化位點Tyr333，p-β-catenin(Y654)磷酸化位點位于Tyr645，兩者參與質核運輸，促進入核；PGK1可能不僅調控β-catenin的表達水平，并且直接參與了后者的磷酸化，這些磷酸化的活性蛋白同樣可以作用于膠質瘤細胞，促進腫瘤生長、增強腫瘤侵襲及遷移能力，最終導致患者的不良預后。

3 討 論

盡管膠質母細胞瘤在人群中發(fā)病率僅為3.2/10萬人[2]，但由于腫瘤惡性度極高，且各種方案的治療效果一般，導致膠質母細胞瘤仍然是目前治療難度最大的惡性腫瘤。因為腫瘤導致的高致殘率及高病死率，不僅威脅患者生命安全，對個人和家庭造成嚴重的傷害，帶來的社會經(jīng)濟負擔更是不可估量。

長久以來，研究人員不斷探索，各種新興治療手段如靶向治療、免疫治療和腫瘤電場治療等均涉獵膠質瘤治療領域，然而患者的生存期延長有限。因此，從膠質細胞瘤的發(fā)生機制、生長過程及環(huán)境、對不同治療方式的敏感性等方面尋找突破點顯得尤為迫切。

以前期研究為基礎，本研究進一步探討了PGK1在膠質瘤中的作用。PGK1最廣為人知的身份是糖酵解過程的關鍵酶，其存在對生物體代謝具有極重要的意義。但在越來越多的研究中，揭示了PGK1不僅是一種代謝相關酶，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關。有觀點認為，糖酵解途徑可以為腫瘤增殖提供合成大分子所需的底物，即碳源。Hu等[7]指出在肝癌細胞中，PGK1對腫瘤細胞增殖及成瘤能力有重要影響， PGK1的異常上調表達廣泛存在于胃癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌等多種高侵襲性腫瘤，被視作不良轉歸的標志[8-11]，但在癌周組織中的含量則接近正常，提示這種異常表達具有一定的腫瘤特異性。在這些非中樞系統(tǒng)腫瘤中，PGK1參與的病理生理過程涉及細胞代謝、基因轉錄及影響腫瘤細胞微環(huán)境等各個方面。

本研究結果提示PGK1的表達水平與膠質瘤的侵襲能力相關，并且可能激活β-catenin的表達。β-catenin通過介導基因轉錄過程，可以影響腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移等行為[12-14]，下游靶點可能有趨化因子受體4(CXCR4)、轉錄因子4(TCF4)等[15-18]，通過影響腫瘤新生血管形成及改變細胞粘附能力，促進腫瘤細胞經(jīng)血液廣泛轉移[19]。一方面β-catenin表達活躍可促進腫瘤轉移、浸潤生長等惡性進程[20-23]，另一方面當β-catenin活性被抑制時，腫瘤的生長將被削弱[24]。本研究結果證實了在膠質瘤中PGK1可能通過影響β-catenin的作用，促進腫瘤生長及侵襲過程，但其中的具體機制目前尚不十分明確。但本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin的幾種磷酸化形式：p-β-catenin(S552)、p-β-catenin(Y142)、p-β-catenin(Y333)、p-β-catenin(Y645)、p-β-catenin(S675)均出現(xiàn)了與PGK1表達同向的變化，β-catenin的磷酸化是其重要的活化形式，提示或許PGK1通過對β-catenin的磷酸化來完成調控過程。根據(jù)磷酸化位點的不同，β-catenin參與了與轉錄因子的結合(S675)，破壞細胞間粘附及連接(S552及Y142)，質核運輸，促進入核(Y333及Y645)等過程。這些作用對于腫瘤細胞的增殖、侵襲至關重要。深入研究PGK1對β-catenin的調控機制將是今后的重要探索方向。

綜上所述，PGK1的過表達對膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移均有促進作用，其機制可能與調控β-catenin表達及對后者的磷酸化相關。在2016新版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中，將分子分型對腫瘤的診斷提升到了非常重要的位置，為科研、臨床及腫瘤流行病學提供了確實的指導，同時顯示出今后腫瘤學中，分子標志物必將有廣闊而光明的應用前景。進一步求證PGK1在膠質瘤中的未解之謎，評估其作為分子標志物的可能性，或許終有一日，可為膠質瘤的多元化、個性化治療方案提供選擇。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。