馬曉曉，董海平，周薇，忻紀(jì)華，王震虹

腦卒中是世界范圍內(nèi)人類死亡和殘疾的主要原因，是僅次于缺血性心臟病的第二大死亡原因。根據(jù)最新發(fā)布的《2016年腦卒中流行病學(xué)報告》顯示，腦卒中已成為中國居民第一致殘原因。在所有腦卒中病例中，高達(dá)86%是缺血性腦卒中[1]。眾所周知，在缺血性腦卒中期間血液供應(yīng)受損后出現(xiàn)的低氧和低葡萄糖等狀態(tài)，導(dǎo)致血腦屏障(blood brain barrier，BBB)破壞，形成血管源性水腫并發(fā)生出血轉(zhuǎn)化[2]，后續(xù)出現(xiàn)神經(jīng)元損傷[3]。因此，BBB的保護已成為預(yù)防缺血性腦卒中腦血管功能障礙的重要治療策略。

κ阿片受體(kappa opioid receptor，KOR)在人類和動物的大腦組織中分布廣泛，不僅在腦皮質(zhì)和海馬紋狀體等部位表達(dá)豐富[4]，在腦血管內(nèi)皮中也高水平地表達(dá)并發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[5]。近期研究表明，KOR激動劑可以有效地減輕腦缺血再灌注后的神經(jīng)損傷和腦水腫[6]，保護BBB的功能[7]。丹酚A(salvinorin A，SA)作為一種短效的高選擇性KOR激動劑，可以容易地通過BBB，安全性高，對于腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)機制的研究具有獨特的優(yōu)勢[6]。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為BBB最基本的組成結(jié)構(gòu)，其在IRI中起到了關(guān)鍵性作用，內(nèi)皮細(xì)胞功能改善是IRI后BBB穩(wěn)定的基石。因此，本研究將針對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞參與SA對IRI后的腦保護和BBB改善的機制進行闡明。

現(xiàn)有的研究表明，非編碼RNA(noncoding RNAs，NcRNAs)，包括長鏈非編碼RNAs(long noncoding RNAs，LncRNAs)、環(huán)狀RNAs(circular RNAs，CircRNAs)和微RNAs(mini RNAS,MiRNAs)均參與了IRI的病理發(fā)展，可作為生物標(biāo)志物、治療靶點或預(yù)后指標(biāo)[8]。LncRNA-MALAT1是最近才被研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮重要作用的LcnRNA，其作用和內(nèi)皮細(xì)胞的生長、炎癥和增殖以及細(xì)胞緊密連接均有關(guān)系[9]。研究表明，MALAT1在缺血刺激后明顯增加，并參與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和腦微血管完整性的調(diào)控[10-11]。MALAT1定位于細(xì)胞核參與mRNA 前體可變剪切，對mRNAs具有調(diào)節(jié)吸附功能，進而發(fā)揮其下游功能。β-catenin信號通路是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管形成、BBB形成的基礎(chǔ)[12-13]。最近有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin信號對于維持成熟BBB的完整性是必需的，并且在腦卒中患者中可檢測到β-catenin水平的降低和連接蛋白claudin-1的缺失[14]。

因此，本研究采用大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型闡明了SA在缺血再灌注導(dǎo)致的BBB損傷中的保護作用，并探討SA通過促進內(nèi)皮細(xì)胞中MALAT1表達(dá)，進而調(diào)控β-catenin的表達(dá)從而減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善BBB功能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：雄性SD大鼠(180～200 g)，購自上海交通大學(xué)實驗動物中心[SYXK(滬)2018-0028]。人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)，購自美國ScienCell。主要實驗藥物、試劑與儀器：SA(Sigma，美國)；NB(Sigma，美國)；伊文思藍(lán)試劑(Evans Blue,EB,Sigma-Aldrich, 美國)；Cell counting kit-8(Dojindo， 日本)；一抗ZO-1 、occludin (Proteintech，美國)，一抗claudin-5、β-catenin、actin (Abcam，英國)；二抗和DAPI(ZSGB-Bio，中國)；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Yeasen，美國)；siRNA 質(zhì)粒(武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司，中國)；大鼠線栓(北京西濃科技有限公司)；化學(xué)天平(BS110S, Sartourius，德國)；二氧化碳培養(yǎng)箱、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific，美國)；熒光顯微鏡(Ti2E，尼康，日本)。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型制作 在本研究中，使用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)大鼠腹腔注射麻醉后，分離大鼠右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動脈(external carotid artery，ECA)。將圓形尖的單絲尼龍線栓經(jīng)ECA殘端插入ICA，放置線栓后將頸總動脈的絲線結(jié)扎固定，阻斷大腦中動脈起點90 min后恢復(fù)血流灌注。整個手術(shù)過程中使用加熱毯和加熱燈將直腸溫度維持在(37.0±0.8)℃。24 h后參照Bederson 評分評估大鼠腦梗死后神經(jīng)功能障礙。

1.2.2 動物分組及處理 實驗動物分成4組(每組15只)，隨機分組如下：SH組(假手術(shù)組)；MCAO組(大鼠中動脈栓塞組)；SA組(salvinorin A組+MCAO組)；NB組(KOR拮抗劑組+SA+MCAO組)。SH組大鼠進行頸部切口及血管分離操作，不放置線栓。MCAO組采用線栓阻斷一側(cè)頸內(nèi)中動脈90 min后拔除線栓恢復(fù)血流再灌注。SA組為進行MCAO操作過程中于線栓置入后即刻經(jīng)尾靜脈注射SA(20 μg/kg)。NB組為SA前30 min使用KOR拮抗劑norbinaltorphimine (NB,4 mg/kg，尾靜脈注射)，其余同SA組操作。根據(jù)本研究以往文獻(xiàn)中使用的有效劑量選擇本次藥物劑量[15]。

1.2.3 運動神經(jīng)功能檢測 大鼠在MCAO術(shù)后1、2、5 d，用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity score,mNSS)測定大鼠的神經(jīng)功能狀況。如前所述[16]，mNSS被認(rèn)為是大鼠運動、反射、感覺和平衡的評價標(biāo)準(zhǔn)。主要行為終點為神經(jīng)綜合評分(1～6分：輕度損傷；7～12分：中度損傷；13～18分：嚴(yán)重?fù)p傷)。

1.2.4 腦水腫檢測 采用干濕法測定大鼠MCAO后24 h的腦含水量(brain water content，BWC)以便量化腦水腫。取大鼠缺血腦半球，采用化學(xué)天平測定濕重，然后放入烤箱中烘烤(110 ℃，24 h)得到干重。通過下列公式：腦水增益%=(濕重-干重)/濕重×100%計算得出BWC值。

1.2.5 BBB通透性檢測 使用伊文思藍(lán)試劑(Evans Blue,EB)測量BBB的完整性。MCAO后24 h，大鼠尾靜脈注射2% EB(4 mL/kg)，循環(huán)2 h后，用0.9% NaCl經(jīng)口灌注至右心房流出液清晰。然后分離腦梗側(cè)腦半球，稱重，并在37 ℃水浴的甲酰胺溶液中孵育。48 h后，1 000 g離心15 min，分離上清。最后，用分光光度計在632 nm波長對樣品進行檢測，并測量EB滲出量。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 在100 mm培養(yǎng)皿中按照106個/孔的密度，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素和鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于加濕培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞：將細(xì)胞按50%的融合度接種到24孔板，加入培養(yǎng)基DMEM+10%FBS。按照說明將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液加入含有細(xì)胞及原培養(yǎng)液(約含400 μL)的孔中，在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后將培養(yǎng)基換為含血清的完全培養(yǎng)基。將HBMECs隨機分為5組： 空白對照組(Blank組)、糖氧剝奪組(OGD組)、SA組(SA+OGD組)、M組(MALAT1 siRNA+OGD組)、SA+M組(SA+MALAT1 siRNA+OGD組)。SA組為OGD復(fù)氧即刻細(xì)胞培養(yǎng)中加入SA(2 uM)， M組為MALAT1特異性小干擾RNA(siRNA，100 nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后進行OGD處理，SA+M組中細(xì)胞轉(zhuǎn)染同M組處理，OGD復(fù)氧即可加入SA。

1.2.7 OGD模型 棄去細(xì)胞完全培養(yǎng)液，以D-Hank’s沖洗細(xì)胞兩遍，換 Kreb’s 溶液(NaCl 119 mmol/L、KCl 4.7 mmol/ L、KH2PO41. 2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、 CaCl22.5 mmol/L、MgCl21 mmol/L)；置于37 ℃、85% N2+5% CO2+0.02%～0.2% O2密閉缺氧箱中培養(yǎng)6 h，之后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)液，并進行 5% CO2+ 95% 空氣通氣復(fù)氧24 h。

1.2.8 細(xì)胞活性及凋亡檢測 使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細(xì)胞相對活性，96孔板中每孔按4×103個細(xì)胞的密度接種細(xì)胞(每組設(shè)置2個復(fù)孔)，待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；進行OGD模型處理，復(fù)氧24 h；每孔中加入新鮮配制的含 10 μL的毒性檢測液CCK-8，并置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h ；使用酶標(biāo)儀測波長為450 nm的光密度(optical density,OD)值，按公式計算細(xì)胞相對活性=[(對照組OD-實驗組OD)/對照組 OD] ×100%。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率(AnnexinV-FITC/PI雙染法)：收集細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 rpm、4 ℃離心5 min，收集沉淀細(xì)胞并重懸；加入500 μL的1×Binding Buffer重懸浮細(xì)胞；Annexin V-FITC標(biāo)記：加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min；PI標(biāo)記：上機前5 min加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光；上機前，加入200 μL 1×Binding Buffer，進行流式細(xì)胞檢測；用流式細(xì)胞儀檢測：Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測，激發(fā)波長Ex=為488 nm，發(fā)射波長Em=525 nm；PI的紅色熒光通過PI通道(FL2或FL3)檢測，建議使用FL3，激發(fā)波長Ex=535 nm，發(fā)射波長Em=615 nm。此外，應(yīng)使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為Blank組進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。

1.2.9 免疫熒光檢測 制備細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，使用含有0.1% Triton X-100和5%山羊血清的PBS封閉1 h，然后用一抗ZO-1(1∶50), occludin(1∶50)和claudin-5(1∶100)于4 ℃冰箱孵育過夜。0.3% PBST溶液洗片3次，加入與FITC結(jié)合的二抗(1∶100)避光室溫孵育細(xì)胞1 h。0.3% PBST溶液洗片3次，用含DAPI的封片劑封片。使用熒光顯微鏡拍攝熒光圖像。

1.2.10 內(nèi)皮細(xì)胞通透性 用Transwell檢測內(nèi)皮細(xì)胞通透性，每個遷移小室加入100 μL培養(yǎng)基含1×105個細(xì)胞，下室孔中加入600 μL培養(yǎng)基，24 h后分組造模處理，造模處理完成后每個遷移小室加入10 μL FITC-BSA(1 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取100 μL下室孔中的培養(yǎng)基，用熒光分光光度計485/525 nm檢測FITC-BSA漏過情況。

1.2.11 蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)分析 收集細(xì)胞樣本，裂解液裂解后使用BCA法測定樣品蛋白濃度，蛋白變性后可置于-20 ℃冰箱保存。根據(jù)目的蛋白分子量大小選用合適濃度的蛋白電泳膠，進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后室溫封閉1 h。分別使用相應(yīng)一抗(β-catenin、actin：1∶1 000)孵育，放入4 ℃搖床孵育過夜。二抗孵育后(1∶5 000)用ECL顯影液顯影，用Bio-Rad ChemidocXRS+成像系統(tǒng)記錄顯影結(jié)果。使用Image J軟件讀取條帶灰度值，計算并比較目的蛋白表達(dá)變化。

1.2.12 實時熒光定量PCR分析 設(shè)計MALAT1引物(LcnRNA MALAT1-hF GCTCTGTGGTGTGGG-ATTGA； LcnRNA MALAT1-hR GTGGCAAAATGG-CGGACTTT)構(gòu)建MALAT1 siRNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后進行定量PCR檢測，以評估不同siRNA的效率。根據(jù)試劑盒說明，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測濃度。取500 ng總RNA作為模板，用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。用去離子水將cDNA溶液稀釋至濃度為100 ng/μL，按照試劑盒說明操作，根據(jù)反應(yīng)的CT值，計算并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組腦水腫和BBB通透性比較 干濕法結(jié)果顯示，MCAO組腦水含量增加明顯高于SH組(P<0.01)；SA組腦水含量增加明顯低于MCAO組(P<0.05)；而NB組腦水含量增加明顯高于SH組和SA組(P<0.05)。EB結(jié)果顯示，MCAO組EB滲出明顯高于SH組(P<0.01)；SA組EB滲出高于SH組(P<0.05)但明顯低于MCAO組(P<0.05)； NB組EB滲出量較SH和SA組明顯增加(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組運動神經(jīng)功能比較 MCAO術(shù)后1、2、5 d的mNSS評分結(jié)果顯示MCAO組的運動神經(jīng)功能分值明顯高于SH組(P<0.05)；SA組運動神經(jīng)功能分值較M組顯著下降(P<0.05)； NB組的運動神經(jīng)功能分值與SH和SA組相比明顯增加(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組內(nèi)皮細(xì)胞的存活率、凋亡和通透性比較 CCK-8和流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，與Blank組相比，OGD后細(xì)胞活性顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.01)；與OGD組相比，SA組中細(xì)胞相對活性明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3A、B。細(xì)胞通透性結(jié)果顯示，與Blank組相比，OGD組細(xì)胞通透性明顯增加(P<0.01)；與OGD組相比，SA組細(xì)胞通透性明顯降低(P<0.01)。見圖3C。

A：各組細(xì)胞存活率的比較； B：各組細(xì)胞凋亡的比較； C：各組細(xì)胞通透性的比較。與Blank組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OGD組比較：#P<0.05，##P<0.01；與SA組比較:&P<0.05，&&P<0.01；N=5 (只/組)

2.4 各組內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白和β-catenin的表達(dá)比較 免疫熒光結(jié)果顯示，與Blank組相比，OGD組內(nèi)皮細(xì)胞中連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與OGD組相比，SA組內(nèi)皮細(xì)胞中連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。見圖4A。Western Blot結(jié)果顯示， 與Blank組相比，OGD組內(nèi)皮細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與OGD組相比，SA組內(nèi)皮細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。見圖4B。

2.5 MALAT1干擾對各組內(nèi)皮細(xì)胞的影響 RT-PCR結(jié)果可見MALAT1的RNA干擾效率。見圖5A。與Blank組相比，OGD組HBMECs 內(nèi)MALAT1的表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與OGD組相比，SA組HBMECs內(nèi)MALAT1的表達(dá)可明顯增加(P<0.01)。見圖5B。而MALAT1干擾后可見，與SA組相比，SA+M組的內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯降低，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞通透性明顯增加(P<0.05)。見圖3A、B、C。免疫熒光和Western Blot結(jié)果顯示，MALAT1被干擾后，與SA組相比，SA+M組中β-catenin和連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表達(dá)水平也發(fā)生了明顯的降低(P<0.05)。 見圖4A、B。

A：各組內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白occludin，claudin，ZO-1表達(dá)的比較(紅色：occluding,claudin5,ZO-1染色；藍(lán)色：DAPI染色；×20)； B：各組內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin表達(dá)的比較。與Blank組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OGD組比較：#P<0.05，##P<0.01

A：MALAT1的RNA干擾效率； B：各組內(nèi)皮細(xì)胞MALAT1表達(dá)的比較。與Blank組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OGD組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討 論

缺血性腦卒中發(fā)生后，腦血流的中斷導(dǎo)致相應(yīng)區(qū)域的腦血管結(jié)構(gòu)和功能最早遭受到損害，造成缺血區(qū)血供障礙，物質(zhì)交換異常甚至誘發(fā)腦水腫等嚴(yán)重病理損害，最終神經(jīng)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致患者死亡或嚴(yán)重殘疾。腦血管是BBB的主要結(jié)構(gòu)，其中由神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞以及周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞等組成的腦神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)，是BBB的基本結(jié)構(gòu)[17]。目前為止，尚且缺乏對于IRI誘導(dǎo)BBB結(jié)構(gòu)和功能障礙的有效預(yù)防和治療措施。內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成了NVU最內(nèi)側(cè)的一層，是維持BBB功能完整，調(diào)節(jié)腦血管功能和新生等的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[18-20]。有研究證實，腦卒中后內(nèi)皮細(xì)胞的連接蛋白破壞可導(dǎo)致BBB通透性的改變[21]。因此，保護腦血管內(nèi)皮細(xì)胞已成為減輕腦卒中后BBB破壞的關(guān)鍵。因此，本研究使用在體和離體IRI模型進行SA對腦缺血再灌注后腦血管內(nèi)皮的保護及機制的相關(guān)研究。

研究表明高選擇KOR激動劑對于IRI具有腦保護作用，本研究結(jié)果同樣證實SA可以減輕缺血再灌注后的腦損傷和運動神經(jīng)功能障礙。而有研究表明KOR激動劑的腦保護與抑制腦缺血區(qū)神經(jīng)元的凋亡和保護腦血管的完整性有關(guān)[6, 22-23]，但其對BBB的具體保護機制尚不明確。因此，首先本研究在大鼠MCAO模型上通過Evans Blue明確了SA對BBB損傷的保護作用，結(jié)果表明SA能有效減輕MCAO導(dǎo)致的BBB通透性增加。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為在腦缺血刺激時最先受到損傷的細(xì)胞之一，與IRI相關(guān)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等過程的調(diào)控機制值得更多的研究關(guān)注。對此，本研究進一步使用HMEBC的OGD模型探討了SA對BBB的保護作用是否與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。結(jié)果表明，SA可明顯減輕OGD引起的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和通透性增加，起到內(nèi)皮細(xì)胞保護作用。有研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)β-catenin的激活可轉(zhuǎn)錄控制粘附蛋白Claudin的表達(dá)，并對維持BBB功能的完整性具有重要作用[14]。β-catenin作為一種多功能蛋白，既是一種粘附蛋白可以將粘附蛋白粘附到細(xì)胞骨架，也是Wnt信號通路中心的轉(zhuǎn)錄因子[24-25]。在內(nèi)皮細(xì)胞中，連接蛋白不僅起到封閉細(xì)胞間隙的作用，同時也是可對多種外部刺激和病理條件做出快速反應(yīng)的結(jié)構(gòu)[26-27]。內(nèi)皮細(xì)胞中的連接蛋白對于血管微環(huán)境的改變更敏感，其結(jié)構(gòu)的改變可導(dǎo)致內(nèi)皮屏障破壞[28]，并且連接蛋白地表達(dá)可受到Wnt/β-catenin通路的調(diào)控[29]。因此，為明確內(nèi)皮細(xì)胞β-catenin和連接蛋白在SA對內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用中的變化，本研究使用免疫熒光和Western Blot對此進行了分析。結(jié)果顯示，SA可明顯促進OGD后內(nèi)皮細(xì)胞中β-catenin和連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表達(dá)?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究推測SA可通過促進β-catenin的表達(dá)發(fā)揮缺血再灌注后對內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用。

已知MALAT1可參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能和血管生長[30]。正常狀態(tài)下，MALAT1對內(nèi)皮細(xì)胞的影響不明顯，但內(nèi)皮細(xì)胞受到外界刺激時，MALAT1是早期(缺血后數(shù)小時即可明顯增高)發(fā)生改變最明顯的LcnRNA之一，起到了調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的研究表明，當(dāng)出現(xiàn)缺血缺氧時誘發(fā)MALAT1大量表達(dá)，可以明顯抑制細(xì)胞的凋亡發(fā)生[31]。而在體外血管內(nèi)皮細(xì)胞進行OGD處理后，MALAT1可通過調(diào)節(jié)相應(yīng)mRNA的吸附來促進缺血缺氧后細(xì)胞自噬以及提高細(xì)胞的存活[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD后HMEBCs中MALAT1的表達(dá)明顯下調(diào)，而SA的暴露可以明顯上調(diào)OGD后內(nèi)皮細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)。因此，本研究進一步通過siRNA技術(shù)干擾MALAT1在HBMEC中的表達(dá)，探討MALAT1在SA的內(nèi)皮細(xì)胞保護作用中的作用機制。本研究結(jié)果表明，MALAT1表達(dá)被干擾后，SA對HMEBCs的保護作用被拮抗，即細(xì)胞活性降低，內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞通透性增加。同時，SA對于OGD后HMEBCs中β-catenin和連接蛋白(ZO-1、occludin、claudin-5)的表達(dá)促進作用被抑制。因此，明確了SA對OGD后內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用與調(diào)控MALAT1表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示SA可能通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞中LncRNA-MALAT1表達(dá)，促進β-catenin的表達(dá)來減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進而減輕腦缺血再灌注后的BBB損傷，起到腦保護作用。但是本研究尚且有一定的局限性，比如，雖然本研究在離體細(xì)胞實驗中證明SA可通過上調(diào)MALAT1促進β-catenin的表達(dá)來發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護作用，然而，由于信號通路的復(fù)雜性，對于該通路在動物體內(nèi)是否與其他信號通路交互作用，需要進一步的實驗證明。但本研究仍為缺血再灌注后內(nèi)皮細(xì)胞保護減輕BBB損傷的研究提供了新的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。