許廣智，張佳樂，伊西才，魏禮洲，劉衛(wèi)平

2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類第四版修訂版，對于膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)的分類方法進行了革新，將GBM分為異檸檬酸脫氫酶1(isocitric dehydrogenase，IDH1)突變型，IDH1野生型及IDH1未檢測型[1]。經(jīng)過五年的完善，2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類第五版中，制訂了新的分類標準，取消了GBM的IDH突變型，將傳統(tǒng)的WHO Ⅳ級成人GBM分類改為成人型彌漫性膠質(zhì)瘤，并且將其細分為IDH突變型的星形細胞瘤，IDH突變和1p/19q雜合性缺失的少突膠質(zhì)細胞瘤，以及IDH野生型的GBM[2]。WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有極高的異質(zhì)性，生存期短，復發(fā)率高，且易侵襲，多浸潤性增長，與周圍正常腦組織分界不清，是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的腫瘤。其首發(fā)臨床癥狀多以占位效應(yīng)、顱內(nèi)高壓以及癲癇為主，部分研究表明具有癲癇為首發(fā)癥狀的預后較好[3]。目前標準治療方案為最大程度的腫瘤切除術(shù)以及術(shù)后放化療。接受標準治療的患者，自初次診斷起的平均生存期為13.5個月，5年生存率不足5%[4-5]。年齡，切除程度，是否接受標準化治療都是總生存期(overall survival,OS)的臨床特征保護因素[6]。除了臨床特征以外，部分組織學及基因?qū)W標志物表達也與患者的生存期相密切關(guān)。本研究通過分子診斷技術(shù)，對2017年1月—2019年12月西京醫(yī)院神經(jīng)外科收治的97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者進行預后分析。評估臨床特征及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6methylguanine DNA methyltransferase，MGMT)，ATRX，P53,Ki-67蛋白表達及1p/19q雜合性缺失對診斷、預后和治療的影響，并且將IDH野生型的GBM與5例WHO Ⅳ級IDH突變型成人彌漫性膠質(zhì)瘤進行比較，對在新的WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類后的IDH野生型GBM進行預后分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入102例WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者，其中男61例，女41例；年齡20～79歲，平均年齡51.28歲；IDH野生型GBM共97例，IDH突變型星形細胞瘤4例，IDH突變并且1p/19q雜合性缺失少突膠質(zhì)細胞瘤1例。納入標準：(1)所有患者首次因膠質(zhì)瘤入院并且未接受其他治療；(2)所選病例由西京醫(yī)院病理科專家診斷為WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤；(3)患者臨床資料及隨訪完整；(4)腫瘤病理標本符合檢測要求，并具有完整的分子標志物數(shù)據(jù)；(5)術(shù)前無嚴重的心肝腎等系統(tǒng)異常；(6)所有患者對分子檢測知情同意，并簽署知情同意書；(7)所有患者均行全麻下腫瘤全切術(shù)。

1.2 免疫組化方法及表達的判定方法 術(shù)中取出的腫瘤組織置于4 ℃中新鮮凍存并送病理保存，之后用20%緩沖福爾馬林固定包埋在石蠟中，并使用SP法進行免疫組化檢測，使用MGMT單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，P53單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，ATRX單克隆抗體(福州邁新公司，即用型)，IDH突變使用sanger測序法進行檢測。1p/19q雜合性缺失采用Fish法，使用奧林巴斯熒光顯微鏡觀察分析。所有組化結(jié)果高表達指標判定方法：每個切片選擇5個高倍(×400)視野，陽性率細胞大于10%判定為陽性，其中Ki-67陽性細胞率大于20%為陽性，P53彌漫陽性視為突變型(圖1)。

A：ATRX陽性； B：Ki-67陽性； C：MGMT陽性； D：P53彌漫陽性

1.3 切除程度評價及隨訪方法 通過手術(shù)記錄，術(shù)后影像學資料來判定切除程度。通過電話隨訪的方式對患者進行出院后隨訪。術(shù)后生存期定義為手術(shù)日至患者因GBM死亡或隨訪截止時間。平均隨訪日期為18.2個月。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。通過Kaplan-Meier法以生存時間制作生存曲線進行單因素分析，通過Log-rank檢驗進行組間生存率比較。對單因素分析有意義的因素用COX比例風險回歸模型驗證危險因素及風險比率(hazard ratio，HR)，并且引入檢驗水準為0.05，剔除檢驗水準定為0.1。所有檢測均為雙側(cè)檢測并且α為0.05。成人彌漫性膠質(zhì)瘤中IDH突變及IDH未突變型的比較，首先檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性，由于不符合正態(tài)分布，因此以中位數(shù)(25%分位數(shù)，75%分位數(shù))描述，比較采用Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征 本研究中，年齡大于55歲的患者48例(47.0%)；性別比例為男∶女=61∶41；術(shù)前卡氏功能狀態(tài)評分標準(Karnofsky performance status，KPS)評分>70分的78例(76.4%)；術(shù)中完全切除腫瘤的為50例(49%)；術(shù)后接受同步放化療的為57例(55.9%)，僅接受化療的為7例(7.0%),僅接受放療的為1例(1.0%)，接受放化療但并未進行同步放化療的為1例(1.0%)，未接受放化療的為36例(35.0%)。截止2021年10月28日因膠質(zhì)瘤而死亡的89例(87.2%)，平均生存期為19.7(95%CI16.9～22.5)個月，中位生存期為15.5(95%CI13.0～18.0)個月。見表1。

表1 102例WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者臨床特征

2.2 術(shù)后單因素分析結(jié)果 患者年齡，KPS評分，腫瘤是否全切，是否接受同步放化療治療，以及MGMT蛋白表達對生存期有影響(P<0.05)?；颊叩男詣e，ATRX表達，P53突變型表達，1p/19q雜合性缺失對生存期無統(tǒng)計學影響(P>0.05)。見表2。

表2 97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者單因素生存分析

2.3 術(shù)后多因素分析結(jié)果 用COX比例風險模型進行多因素分析顯示，患者的年齡、術(shù)前KPS評分、腫瘤切除程度、是否接受同步放化療治療、MGMT蛋白表達，是生存期的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 97例WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者多因素生存分析結(jié)果

2.4 WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤生存期差別 本研究的IDH野生型成人彌漫性膠質(zhì)瘤中位生存時間為14.53(8.36～23.1)個月，而IDH突變型成人彌漫性膠質(zhì)瘤中位生存時間為33.00(21.85～50.23)個月。兩組都為原發(fā)性WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤。由于樣本不滿足正態(tài)分布，因此使用秩和檢驗可知兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

2021年第五版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類發(fā)布后，對于神經(jīng)系統(tǒng)的研究進入了一個新的階段。之前國內(nèi)外對于膠質(zhì)瘤預后因素分析的研究中，未將WHO Ⅳ級的成人彌漫性膠質(zhì)瘤中的IDH突變型星形細胞瘤和IDH突變型及1p/19q雜合性缺失少突細胞瘤與IDH野生型GBM區(qū)分開。而本研究中，除了通過單因素多因素分析，探討了WHO Ⅳ級IDH野生型GBM相關(guān)的預后因素，還研究WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤中的IDH野生型GBM與其他兩型的預后區(qū)別。本研究通過對97例IDH野生型GBM進行單因素及多因素分析，可知在IDH野生型GBM中，術(shù)前KPS評分，患者年齡，腫瘤切除程度，是否接受同步放化療都是獨立的影響因素，這個結(jié)果與WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤的臨床因素中與預后相關(guān)的獨立影響因素相似[7]。分子標志物中，MGMT蛋白表達是WHO Ⅳ級IDH野生型GBM的獨立影響因素(P<0.05)。既往研究中，MGMT蛋白的低表達是WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤預后中的獨立保護因素[6]；本研究進一步發(fā)現(xiàn)，MGMT蛋白低表達在WHO Ⅳ級IDH野生型膠質(zhì)瘤中是獨立的保護因素。

IDH是三羧酸循環(huán)的重要組成部分，其在WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤中突變率為12%，在繼發(fā)性WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤中突變率為73%，在原發(fā)性WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤中，其突變率僅為3.7%[8-9]。但繼發(fā)性WHO Ⅳ膠質(zhì)瘤中的高IDH發(fā)生率也表明，具有IDH突變的低級別膠質(zhì)瘤常發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化為高級別膠質(zhì)瘤。具有IDH1/2突變的WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者預后明顯好于IDH野生型的GBM患者，既往文獻表明，具有IDH1/2突變的WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者中位OS為31個月，而IDH野生型GBM患者，其中位生存期為15個月[10]。2021年新修訂的WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類第五版，進一步將2016版WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類中的WHO Ⅳ級成人GBM(舊版)分類進行細分，將IDH突變型GBM刪除，保留IDH野生型GBM，但將IDH突變型的成人WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤分類為IDH突變型星形細胞瘤，將IDH突變并伴有1p/19q雜合性缺失的成人WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤分類為IDH及1p/19q雜合性缺失的少突膠質(zhì)瘤，可見IDH突變不僅是膠質(zhì)瘤預后標志物，也是WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤的分類標志物。本研究中通過對比WHO Ⅳ級IDH野生型GBM及IDH突變型WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤，發(fā)現(xiàn)IDH野生型GBM患者生存期更短[2]，因此術(shù)后常規(guī)進行IDH基因檢測，除了可以更好地對WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤進行分類，還可以更好地預測患者的預后。

MGMT基因是膠質(zhì)瘤最重要的甲基化標志物。MGMT編碼的DNA修復蛋白可以將鳥嘌呤O6位置的烷基基團清除，但當DNA修復消耗的MGMT蛋白不足時，會導致未修復的DNA受到損傷。MGMT啟動子甲基化可使MGMT蛋白表達受到抑制，可能加強DNA對烷基化試劑(替莫唑胺)的敏感性。并且膠質(zhì)瘤一些位點的基因啟動子甲基化，會導致某些抑癌基因的表達水平改變[11]。同時，對于具有IDH1突變和MGMT啟動子甲基化的WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤，替莫唑胺的療效更好[12]。雖然有多項研究證實MGMT啟動子甲基化與MGMT蛋白的表達呈負相關(guān)，但MGMT啟動子甲基化與MGMT蛋白表達并不完全一致[13]。MGMT蛋白在舊的分類的WHO Ⅳ級GBM中，作為一種單獨預后標志的作用已被證實，并被廣泛運用于膠質(zhì)瘤的分子標志物檢查中[6]。本研究中，MGMT啟動子甲基化在WHOⅣ級IDH野生型GBM中的單因素及多因素分析中有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且MGMT蛋白的低表達為保護因素，因此應(yīng)當積極地對進行了腫瘤全切術(shù)的IDH野生型GBM患者進行術(shù)后常規(guī)MGMT啟動子甲基化或者蛋白表達量檢測，可以更好地對患者術(shù)后生存時間進行預測。

ATRX蛋白表達、P53突變型表達、Ki-67表達在其他類型的腫瘤中有發(fā)現(xiàn)與預后相關(guān)[14-17]，但既往文獻中沒有報道這三種分子的蛋白表達對于WHO Ⅳ級IDH野生型GBM的預后是否相關(guān)，因此本研究將這三種分子標志物納入分析因素中，并證實這三種分子標志物與IDH野生型GBM預后不相關(guān)。 其中ATRX基因是地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征的致病基因，位于X染色體，其基因突變導致的ATRX蛋白缺失，與端粒替代延長機制(alternative lengthening of telomeres,ALT)密切相關(guān)[14]。約80%的原發(fā)性和7%的繼發(fā)性WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤會具有ATRX突變，并且通常伴隨有IDH突變[7]。在WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，具有ATRX缺失的間變性膠質(zhì)瘤預后明顯好于沒有ATRX缺失的間變性膠質(zhì)瘤[14]，在WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，ATRX突變僅占很少的部分(3%)，但有研究表明雖然在IDH突變型WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤中ATRX與預后不相關(guān)，但在WHO Ⅳ級IDH野生型成人彌漫性膠質(zhì)瘤中，ATRX突變型與ATRX野生型相比，其生存率增加[18]。P53基因包括突變型和野生型，其中野生型為抑癌基因。突變型在免疫組化上呈高表達并且與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)[19]。P53主要通過改變參與細胞周期、凋亡和細胞衰老的眾多基因的表達來發(fā)揮作用[20]。雖然在其他類型腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P53突變與預后相關(guān)[15]，但P53突變與WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤預后的相關(guān)性仍存在爭議[21]。Ki-67是一種非組蛋白，在增殖細胞的整個細胞周期中表達，但在靜止細胞(G0)中不表達，被用于區(qū)分生長細胞和非生長細胞[22]。有薈萃分析報道，Ki-67的高表達與低生存期相關(guān)[16]。1p/19q雜合性缺失，即染色體1短臂和染色體19長臂的共同缺失，導致染色體臂著絲粒移位。其中，1p/19q雜合性缺失及IDH突變共同出現(xiàn)的膠質(zhì)瘤定義為少突膠質(zhì)瘤[1]。1p/19q雜合性缺失在低級別膠質(zhì)瘤中常見，但1p/19q雜合性缺失在WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤中很少見。1p/19q雜合性缺失是否和WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者的預后相關(guān)仍有爭議[17,23]，由于1p/19q雜合性缺失有假陽性的可能，主要用于膠質(zhì)瘤的分類中[24]。本研究中, Ki-67蛋白表達量以及1p/19q雜合性缺失與預后不相關(guān)(P>0.05)，可能與樣本量不足或判讀方式的誤差有關(guān)，如Fish檢測的假陽性。ATRX蛋白表達，P53突變型表達也與膠質(zhì)瘤預后不相關(guān)(P>0.05)，雖然它們的基因突變被證明與WHO Ⅳ級成人彌漫性膠質(zhì)瘤預后相關(guān)，但其蛋白表達與預后不相關(guān)可能與其基因表達與蛋白質(zhì)表達并不一致有關(guān)。

綜上所述，本研究探討了在2021年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)新分類下的WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，臨床因素以及分子標志物蛋白表達與預后的關(guān)系。在WHO Ⅳ級IDH野生型GBM中，除了年齡、腫瘤的切除程度、術(shù)前KPS評分以及患者術(shù)后是否接受同步放化療為評估患者預后的獨立的臨床因素(P<0.05)， MGMT蛋白的低表達作為分子標志物也是獨立的保護因素。并且ATRX,P53, Ki-67蛋白表達以及1p/19q雜合性缺失與WHO Ⅳ級IDH野生型GBM預后不相關(guān)(P>0.05)。因此，術(shù)后可以對患者進行分子標志物的檢測，除了可以更好地對患者進行臨床分型，也可以對患者預后及治療進行指導。本研究為單中心研究，樣本量仍有一定局限，后續(xù)會進行臨床多中心研究，以進一步探索WHO Ⅳ級IDH野生型GBM患者的預后因素以期望更好的指導臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。