石爽，鐘佳成，劉備，張彪，楊彪，牛文勇，李柏成，覃川，鐘東，張正保

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，盡管目前膠質(zhì)瘤的多模態(tài)治療取得一定的進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤患者的治療仍不理想，對(duì)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，其中位生存期仍低于2年[1]。GAS2L3是最近發(fā)現(xiàn)的微管蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂和脫落，在細(xì)胞的有絲分裂和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。但是GAS2L3在膠質(zhì)瘤上的表達(dá)及功能，以及是否與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)及患者預(yù)后相關(guān)尚未研究。本研究擬利用基因表達(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)網(wǎng)站評(píng)估GAS2L3在正常腦組織和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異，通過(guò)R語(yǔ)言分析腫瘤基因圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中GAS2L3與膠質(zhì)瘤的等級(jí)與預(yù)后的相關(guān)性，通過(guò)差異分析尋找GAS2L3在膠質(zhì)瘤中的潛在功能，以期為膠質(zhì)瘤提供新的治療靶點(diǎn)和研究思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取與處理 從美國(guó)TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載膠質(zhì)瘤組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)數(shù)據(jù)。按照項(xiàng)目為T(mén)CGA-Repository-Brain、疾病類(lèi)型為低級(jí)別膠質(zhì)瘤(low grade glioma,LGG)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)、實(shí)驗(yàn)策略為RNA-seq、工作流程的類(lèi)型為HTseq-Counts進(jìn)行篩選，共獲得702例膠質(zhì)瘤組織樣本及其臨床信息。利用R語(yǔ)言(版本號(hào)R version 4.0.4)將counts數(shù)據(jù)與人類(lèi)基因組注釋文件GTF進(jìn)行合并處理，生成行為基因、列為樣本的基因表達(dá)矩陣。根據(jù)樣TCGA的編碼去除6例重復(fù)的膠質(zhì)瘤組織樣本，最終得到696個(gè)GBM和LGG組織樣本。

1.2 GAS2L3的表達(dá)情況及與膠質(zhì)瘤等級(jí)和預(yù)后的關(guān)系 在GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php gene)網(wǎng)頁(yè)中，點(diǎn)擊進(jìn)入Expression DIY 界面，以GAS2L3為目的基因，分別選取GBM和LGG，以TCGA normal和GTEx data中的正常腦組織為配對(duì)，分別在GBM和LGG與Normal組織中對(duì)GAS2L3基因進(jìn)行表達(dá)水平的驗(yàn)證。下載TCGA中膠質(zhì)瘤RNA-seq和臨床信息，合并后分析GAS2L3表達(dá)量與膠質(zhì)瘤等級(jí)的相關(guān)性，以GAS2L3表達(dá)量的中位數(shù)為Cut-off值，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.3 GAS2L3的風(fēng)險(xiǎn)比 患者信息均來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，總共703例膠質(zhì)瘤病例，去掉6例復(fù)發(fā)行二次測(cè)序后重復(fù)數(shù)據(jù)，696例符合分析標(biāo)準(zhǔn)；其中男351例，女253例(男女比例約為1.38∶1)；IDH1突變者423例，野生型253例；1p/19q非聯(lián)合缺失490例，聯(lián)合缺失168例。患者的年齡，性別，等級(jí)，IDH1突變，1p/19q以及GAS2L3均進(jìn)行了單因素或多因素的COX回歸分析。

1.4 GAS2L3與膠質(zhì)瘤增殖、侵襲、凋亡和血管形成的關(guān)系 TCGA中膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)下載后，在R語(yǔ)言(版本號(hào)R version 4.0.4)環(huán)境下，使用limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化，考慮到腫瘤基因的非正態(tài)分布，采用Spearman計(jì)算GAS2L3與人類(lèi)增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA),MKI67,MMP-9,MMP-3,CASP3,CASP8,CD34和PECAM1的相關(guān)系數(shù)，并繪制散點(diǎn)圖。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選 在R語(yǔ)言(版本號(hào)R version 4.0.4)環(huán)境下，使用limma包進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化[3]，排除基因長(zhǎng)度、測(cè)序深度和文庫(kù)不同的影響，并進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選，篩選條件為基因表達(dá)差異倍數(shù)的絕對(duì)值(logFC>1且P<0.05)的標(biāo)準(zhǔn),得到最終有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因,并通過(guò)熱圖聚類(lèi)分析差異基因的分布情況，火山圖展示差異基因的差異情況。

1.6 數(shù)據(jù)庫(kù)分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步將差異基因分析得到的數(shù)據(jù)集(logFC>1且P<0.05)塊進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集，以明確該模塊中的基因所涉及的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及細(xì)胞定位(cellular components，CC)。同時(shí)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析，以便于明確這些基因參與到哪些代謝途徑及信號(hào)通路，基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)分析GAS2L3對(duì)相關(guān)細(xì)胞信號(hào)通路抑制和激活。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(版本號(hào)R version 4.0.4)。腫瘤組織和正常腦組織GAS2L3表達(dá)的比較采用one-way ANOVAG方法；Wilcoxon秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證GAS2L3與膠質(zhì)瘤等級(jí)的相關(guān)性；log-rank檢驗(yàn)GAS2L3與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系；GAS2L3的風(fēng)險(xiǎn)比采用單因素或多因素的COX回歸分析，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)；GAS2L3高表達(dá)與低表達(dá)組織的差異分析基于負(fù)二項(xiàng)分布的統(tǒng)計(jì)方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙尾)。

2 結(jié) 果

2.1 GAS2L3在不同組織的表達(dá)差異 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，GBM組織中GAS2L3 mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖 1A，但是LGG組織中GAS2L3 mRNA 表達(dá)水平與正常腦組織有差異，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)圖1B。

圖1 GAS2L3在不同組織的表達(dá)情況

2.2 GAS2L3與膠質(zhì)瘤的等級(jí)及預(yù)后的相關(guān)性 在TCGA膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GAS2L3 mRNA水平隨著膠質(zhì)瘤的等級(jí)表達(dá)增高而增高(P<0.05)，見(jiàn)圖2A；以GAS2L3表達(dá)量的中位數(shù)為Cut-off值，繪制Kaplan-Meier生存曲線，log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GAS2L3高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的預(yù)后不良明顯相關(guān)，見(jiàn)圖 2B。

2.3 GAS2L3是膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后因素 單因素和多因素的方差分析顯示年齡、腫瘤等級(jí)、IDH1野生型、及GAS2L3均為患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，其中1p/19q非聯(lián)合缺失單因素分析其與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，多因素分析顯示其為患者不良預(yù)后因子，但P值處于臨界值。單因素分析顯示中 GAS2L3的風(fēng)險(xiǎn)度為HR=2(95%CI=1.8-2.2)，在多因素回歸分析中，GAS2L3的風(fēng)險(xiǎn)比率(hazard ratio，HR)=1.2(95%CI=1.01～1.4)，說(shuō)明GAS2L3的表達(dá)量越高，患者的預(yù)后越差。這些結(jié)果表明GAS2L3的表達(dá)水平能夠作為膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后因素。見(jiàn)表1。

表1 GAS2L3的表達(dá)水平與患者預(yù)后的單因素和多因素分析結(jié)果

2.4 GAS2L3與膠質(zhì)瘤和血管形成的相關(guān)性 Spearman秩相關(guān)顯示，GAS2L3在膠質(zhì)瘤中與PCNA和MKI67明顯相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.78和0.74；與MMP-9的相關(guān)系數(shù)為0.68，但與MMP-3的相關(guān)系數(shù)為0.21；同時(shí)本研究還檢測(cè)其與膠質(zhì)瘤凋亡和血管形成的相關(guān)系數(shù)，與CASP3和CASP8的相關(guān)系數(shù)為0.68和0.57，與CD34和PECAM1的相關(guān)系數(shù)分別為0.3和0.53。見(jiàn)圖 3。

圖3 GAS2L3與不同因素相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 GAS2L3不同樣本的差異基因分析 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的696個(gè)臨床樣本, 以GAS2L3的表達(dá)情況由低到高進(jìn)行排序，將GAS2L3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤樣本與GAS2L3低表達(dá)膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行差異分析，篩選條件為基因表達(dá)差異倍數(shù)的絕對(duì)值(logFC>1且P<0.05)的標(biāo)準(zhǔn)，共獲取2 887個(gè)差異表達(dá)基因，火山圖顯示全差異變化情況(圖4A)，聚類(lèi)熱圖顯示2 887個(gè)差異分布情況(圖4B)。

A：火山圖展示差異基因表達(dá)情況； B：聚類(lèi)熱圖顯示差異基因的分布情況(logFC>1且P<0.05)

2.6 富集分析 將獲取的2 887個(gè)基因通過(guò)R4.0.0進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換,通過(guò)clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot數(shù)據(jù)包,對(duì)交集基因做GO與KEGG富集分析。GO富集分析顯示GAS2L3在膠質(zhì)瘤中與細(xì)胞膜的膜電位，離子通道和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)(圖5A)；KEGG富集分析顯示與細(xì)胞的黏附分子，鈣信號(hào)內(nèi)流和蛋白質(zhì)的溶解和吸收相關(guān)(圖5B)。此外GO與KEGG還顯示GAS2L3與細(xì)胞周期相關(guān)，圖5根據(jù)P值從低到高顯示，細(xì)胞周期未顯示；GSEA對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路分析顯示，GAS2L3激活細(xì)胞周期通路(圖6、圖7)。

圖5 差異基因的GO富集和KEGG分析

圖6 GAS2L3差異基因富集的信號(hào)通路GSEA分析

圖7 GSEA分析顯示GAS2L3對(duì)CELL CYCLE信號(hào)通路的激活

3 討 論

本研究通過(guò)GEPIA網(wǎng)站分析TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中，GAS2L3正常腦組織和腫瘤組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GAS2L3高表達(dá)于GBM中。在對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)膠質(zhì)瘤及其臨床信息數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，GAS2L3隨著膠質(zhì)瘤的等級(jí)增加表達(dá)增強(qiáng)，并且通過(guò)生存曲線發(fā)現(xiàn)GAS2L3高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步明確GAS2L3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本研究通過(guò)Spearman秩相關(guān)計(jì)算了GAS2L3與膠質(zhì)瘤的增殖和侵襲的指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GAS2L3與膠質(zhì)瘤的增殖相關(guān)。同時(shí)本研究分析了GAS2L3高表達(dá)的膠質(zhì)瘤組織和GAS2L3低表達(dá)的膠質(zhì)瘤組織基因的差異性，選取差異倍數(shù)為1倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的2 887個(gè)基因，分析了這些差異基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的潛在功能，發(fā)現(xiàn)GAS2L3可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期蛋白信號(hào)通路的激活，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。

微管(microtubule，MT)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是細(xì)胞完整性的基礎(chǔ)，因?yàn)樗鼈兛刂浦S多細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、極化和遷移，介導(dǎo)MT和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的相互作用的蛋白質(zhì)是許多細(xì)胞過(guò)程的關(guān)鍵，并起著重要的生理作用[4]。GAS2蛋白家族就是連接MT和肌動(dòng)蛋白骨架的一類(lèi)蛋白，推測(cè)其至少由肌動(dòng)蛋白結(jié)合[actin-binding(CH) domain]結(jié)構(gòu)域和微管結(jié)合[microtubule-binding(GAR) domain]結(jié)構(gòu)域組成。盡管GAS2被定義為生長(zhǎng)停滯特異性蛋白家族，但迄今為止尚未系統(tǒng)地研究過(guò)不同GAS2家族成員在不同疾病中表達(dá)模式，相互作用以及生物學(xué)功能[5]。GAS2家族包含有GAS2，GAS2L1，GAS2L2和GAS2L3四個(gè)成員[5]， GAS2蛋白在肝癌[6]、白血病[7]、復(fù)發(fā)性結(jié)腸癌[8]、前列腺癌[9]、乳腺癌[10]和肺腺癌[11]中得到了廣泛得研究，但GAS2L1，GAS2L2和GAS2L3的研究較少，最近的研究顯示GAS2L3是DREAM復(fù)合物的靶基因，而DREAM復(fù)合物是細(xì)胞周期調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可驅(qū)動(dòng)有絲分裂和胞質(zhì)分裂所需的許多基因產(chǎn)物的表達(dá)[12-13]，因此GAS2L3可能參與細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡和癌癥發(fā)展。

為了進(jìn)一步明確GAS2L3在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式和生物學(xué)功能，本研究基于生物學(xué)信息技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)GAS2L3高表達(dá)于GBM中，但在低級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常的腦組織低表達(dá)，并且低級(jí)別的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常腦組織的表達(dá)水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其可能與GBM的惡性生物學(xué)行為相關(guān)。Ki-67是一種存在于增殖細(xì)胞中的核抗原，其表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，其在細(xì)胞周期G0期無(wú)表達(dá)，但在G1、S、G2、M期均有表達(dá)，是反映細(xì)胞生長(zhǎng)活躍程度的標(biāo)志，即 Ki-67表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)越活躍，惡性程度越高，它是目前應(yīng)用最廣泛，也是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一。PCNA位于第20號(hào)染色體，它是DNA復(fù)制和DNA修復(fù)所必需的酸性非組胺核輔助蛋白，其分子量為36KD，僅在增殖細(xì)胞中合成與表達(dá)；目前研究顯示，PCNA的表達(dá)水平直接與膠質(zhì)瘤惡性度相關(guān)[14-15]。腫瘤的侵襲涉及多個(gè)步驟：(1)腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜表面受體粘附到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)層粘蛋白上；(2)活化并釋放的蛋白水解酶前體對(duì)ECM的水解;(3)腫瘤細(xì)胞通過(guò)基底膜遷移，其中ECM的降解是判斷腫瘤具有侵襲性的重要標(biāo)志之一。目前的研究顯示，MMP-9和MMP-3與膠質(zhì)瘤的侵襲和遷移密切相關(guān)[16-17]；在凋亡過(guò)程中，caspase幾乎是所有細(xì)胞凋亡晚期的最后共同途徑。caspase是一類(lèi)進(jìn)化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族，激活的 caspase能水解包括細(xì)胞生命活動(dòng)各環(huán)節(jié)中的蛋白，使細(xì)胞皺縮、斷裂、染色質(zhì)聚集、DNA降解凋亡，其中 caspase-8和caspase-3是兩種執(zhí)行凋亡調(diào)控功能的核心蛋白酶，是細(xì)胞凋亡內(nèi)源性和外源性途徑的必須 caspase分子，目前研究表明caspase-8和caspase-3能夠反映膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，能抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)[18]。CD34和CD31 在新生血管及非新生血管，包括大血管的內(nèi)皮細(xì)胞上，均呈陽(yáng)性表達(dá)，可作為內(nèi)皮細(xì)胞的特異標(biāo)記物；有研究顯示其表達(dá)明顯高于正常腦組織，且隨腫瘤級(jí)別增高呈增高趨勢(shì)，可用于標(biāo)記腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本微血管密度(microvessel density，MVD)[19-20]。本研究分析顯示，GAS2L3與Ki-67和PCNA明顯正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤的侵襲、凋亡和腫瘤的微血管形成具有一定的相關(guān)性。此外，雖然GAS2L3在GBM特異性表達(dá)，但是目前的測(cè)序顯示其表達(dá)豐度較低，雖然通過(guò)臨床數(shù)據(jù)分析，其與膠質(zhì)瘤的等級(jí)成正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，但是其在膠質(zhì)瘤的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。與此同時(shí)，在對(duì)GAS2L3高表達(dá)和低表達(dá)的膠質(zhì)瘤組織的差異基因分析中，本研究通過(guò)GO和KEGG的富集分析發(fā)現(xiàn)，GAS2L3相關(guān)的基因主要參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜的膜電位，與離子通道和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，但仍影響膠質(zhì)瘤的細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期過(guò)程，GAS2L3表達(dá)增加激活細(xì)胞周期相關(guān)的信號(hào)通路，其具體的信號(hào)通路也需要實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述， GAS2L3高表達(dá)于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，且其表達(dá)強(qiáng)度可能與膠質(zhì)瘤的等級(jí)相關(guān)。 GAS2L3可能膠質(zhì)瘤的增殖密切相關(guān), 與膠質(zhì)瘤的侵襲、凋亡和腫瘤的微血管形成具有一定的相關(guān)性，其可能參與瘤細(xì)胞細(xì)胞周期信號(hào)通路的激活，有望成為膠質(zhì)瘤生物治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為尋找膠質(zhì)瘤的特異靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)，但缺乏進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)和動(dòng)物體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)支持，下一步將進(jìn)行深入的研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。