溫小龍，李駿鵬，劉鑫鑫，李宗慧，熊蕓雲(yún)，虞道銳

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，海南 ?？?570311；2. 海南醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，海南 ?？?571199；3. 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199）

腦卒中是常見的心腦血管疾病、是由于腦組織血液循環(huán)異常而引起腦損傷的疾病，臨床上主要分為出血性和缺血性腦卒中，缺血性腦卒中占腦血管疾病的比率極高，達(dá)到了80%左右［1］?？v觀全球的腦血管疾病，由于腦動(dòng)脈閉塞引發(fā)的急性缺血性腦損傷是關(guān)鍵因素，發(fā)病年齡多見老齡人群，其發(fā)病率和死亡率較高［2］。我國(guó)衛(wèi)生部衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)研究所的一份報(bào)告顯示，來自腦血管疾病的花銷每年超過上百億人民幣，帶來日益嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［3］。一旦發(fā)生腦缺血損傷，會(huì)有一系列的變化引起神經(jīng)元等腦組織腫脹、變性、死亡，比如氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放、興奮性氨基酸釋放等［4］。目前，對(duì)該病有效的治療藥物較少，患者從中受益少，且容易造成出血和再灌注損傷風(fēng)險(xiǎn)，因此，迫切深入探索有效的神經(jīng)保護(hù)藥物，發(fā)展神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域工作尤為重要。

葉 下 珠［Phyllanthus urinaria（P. urinaria）L.］屬大戟科葉下珠屬植物，別名珍珠草，廣泛生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)主要生長(zhǎng)于兩廣和海南地區(qū)［5］。作為一味傳統(tǒng)中藥，其味微苦、性涼，具有清熱解毒、利水消腫等功效，在治療腸炎出現(xiàn)的痢疾、泄瀉及無名腫痛等疾病頗為見長(zhǎng)［6］?，F(xiàn)代藥理表明，葉下珠有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓的作用［7］，其毒副作用低，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。且葉下珠在治療急性腦缺血方面，尚未見有深入的報(bào)道。因此，本研究采用SD 大鼠，通過改良線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型?？疾烊~下珠提取物對(duì)急性腦缺血損傷后的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，為發(fā)展新治療該疾病的藥物提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

SOD 測(cè)試試劑盒：Solarbio 公司，生產(chǎn)批號(hào)：20181117；NO 測(cè)試試劑盒：南京建成生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20180609、eNOS 測(cè)試試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司，生產(chǎn)批號(hào)：S1817；兔抗大鼠Caspase-3 多克隆抗體：Abcam 公司，生產(chǎn)批號(hào)：ab18137；PI3K 多 克 隆 抗 體：Abcam 公 司，生 產(chǎn) 批號(hào)：ab191607；Akt 多克隆抗體：Abcam 公司，生產(chǎn)批 號(hào)：ab18785；顯 色 劑DAB：Invitrogen 公 司，生產(chǎn)批號(hào)：191013；激光多普勒血流測(cè)量?jī)x：英國(guó)moor 公 司；熒 光 顯 微 鏡：Olympus 公 司szx16 型；專業(yè)圖像處理分析系統(tǒng)Image Pro Plus v6.0：美國(guó)Media Cybernetics 公司。

1.2 葉下珠提取物制備及給藥

所用葉下珠由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所采集，海南醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)考研室提供提取制備工藝來制備葉下珠提取物。即稱取葉下珠適量，先蒸餾水浸泡30 min 后武火加熱，煮沸后調(diào)文火繼續(xù)煮1 h，然后攪拌過濾。藥渣以同樣方法重復(fù)操作兩次后合并濾液，最后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，根據(jù)所需濃度加水稀并灌封至4 ℃冰箱保存。MCAO 造模前以灌胃給藥途徑1 次/d給藥量，葉下珠提取物組大鼠以最大致死量的藥量的10% 確定給藥劑量，分別以5、10 g/kg 兩個(gè)劑量連續(xù)給藥，假手術(shù)組、MCAO 組大鼠給予同等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥7d 后制作大鼠實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷模型（MCAO）模型，并繼續(xù)灌注藥液1 次/d 直至取材。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與MCAO 模型制備

健康成年SD 大鼠：長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司，數(shù)量72 只，清潔級(jí)，體質(zhì)量：280～350 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（湘）2018-001。室溫分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)1 周實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后以每組18 只的數(shù)量隨機(jī)分為假手術(shù)組，葉下珠提取物低、高劑量組（PuL 5、10 g/kg）。本研究所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均遵守海南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，手術(shù)時(shí)模擬臨床使用麻醉、給藥時(shí)嚴(yán)格規(guī)范操作以減少不適，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)未死亡的動(dòng)物采用脫臼安樂死的手段進(jìn)行處理，并暫存于學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物冰箱中，由學(xué)校統(tǒng)一處理。

第7 天給藥1 h 后開始造模，參照改良的Lon?ga 線栓法制備大鼠實(shí)驗(yàn)性缺血性模型（MCAO 模型）［8］，具體操作如下：大鼠按體重腹腔注射1.5% 濃度的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，接下來以暴露頸部的方向固定在鼠板上，切開頸部皮膚，用止血鉗鈍性分離肌肉組織，直至暴露頸動(dòng)脈三角。分離出頸總動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈穿一條手術(shù)線備用提拉，再細(xì)心分離分叉處頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。用4 號(hào)黑絲線結(jié)扎阻斷頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈則用動(dòng)脈夾阻斷，用眼科剪在頸總動(dòng)脈靠近分叉口的位置斜45 度剪開一小口，把事先制備好的魚線從頸總動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈方向插入約為18 mm 的深度，阻斷大腦中動(dòng)脈起始部讓其缺血狀態(tài)。2 h 后將魚線拔出一小段，造模即完成。假手術(shù)組僅分離不做插管。

1.4 主要檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分 各組大鼠末次給藥制備MCAO 大鼠模型后。在24、48、72 h 進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分。參照Longa 神經(jīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［9］進(jìn)行操作。0～5 分進(jìn)行評(píng)分作為MCAO 模型制備成功的標(biāo)志，并將作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察評(píng)估受試藥有無保護(hù)神經(jīng)的作用。

1.4.2 腦組織梗死面積檢測(cè) MCAO 造模成功后第72 小時(shí)進(jìn)行TTC 染色實(shí)驗(yàn)，將各組隨機(jī)取出6只大鼠用1.5%的戊巴比妥鈉麻醉后，立刻斷頭取出全腦組織，冰生理鹽水洗凈表面的血跡后放在合適的大鼠腦模槽中。放置在-20 ℃的冰箱中至變硬后取出，用手術(shù)刀片切成冠狀片，每張切片間隔2 mm 左右。將切好的腦片放置于已配好的1%TTC溶液中染色，可見梗死區(qū)域不著色，而其余區(qū)域均變紅。最后拍照測(cè)量全腦區(qū)和梗死區(qū)面積，此步驟用專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus v6.0）來完成，接下來計(jì)算出梗死面積的比率以反映梗死灶的大小，公式為：梗死區(qū)面積/全腦區(qū)面積×100%。

1.4.3 腦組織SOD、NO、eNOS 水平的檢測(cè) 在72 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分后，各組隨機(jī)取6只大鼠以1.5%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭冰上取腦組織洗凈后，加冰生理鹽水勻漿，在低溫離心機(jī)中以3 000 r/min離心15 min，取上清液放置冰箱中備用，檢測(cè)時(shí)取出已制備好的上清液根據(jù)SOD、NO、eNOS 試劑盒中的說明嚴(yán)格操作，檢測(cè)各組大鼠腦組織中SOD、NO、eNOS 的水平。

1.4.4 Caspase-3 免疫熒光染色檢測(cè) 余下各組大鼠于72 h 神經(jīng)功能評(píng)分后麻醉，并予4 ℃PBS 緩沖液和4%多聚甲醛灌注，灌注固定后取腦，以冠狀平均切成兩份，一份腦組織放-80 ℃冰箱中保存，另一份腦組織進(jìn)行石臘包埋并切片，此操作多制備幾張腦組織切片，隨機(jī)抽取各組一張腦組織切片經(jīng)脫蠟滲水，再抗原修復(fù)后，用記號(hào)筆圈片上的腦組織，滴加caspase-3 抗體在圈內(nèi)的腦組織上，放置于4℃冰箱中，第2 天取出滴加熒光二抗，常溫放置1 h，用PBS 緩沖液沖洗，用碘化吡啶復(fù)染，甘油固定封存并干燥。觀察caspase-3 的陽(yáng)性表達(dá)情況，此步驟采用熒光顯微鏡采集圖片，再經(jīng)專業(yè)圖像分析系統(tǒng)（Image Pro Plus v6.0）分析其表達(dá)情況。每個(gè)標(biāo)本以5 個(gè)不同視野分別計(jì)數(shù)染色結(jié)果，確定陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均值。

1.4.5 腦組織中PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

從-80 ℃冰箱中取出另一份腦組織，加入裂解緩沖液中勻漿，冰浴10 min，提取各組大鼠腦組織總蛋白備用，以文獻(xiàn)［10］中的蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）方法步驟進(jìn)行操作。最后滴加ECL 發(fā)光液顯色，通過凝膠圖像處理系統(tǒng)曝光和采照。用GAP?DH 作為對(duì)照在專業(yè)圖像軟件分析腦組織中PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 26.0 分析，采用t檢驗(yàn)分析兩兩比較兩獨(dú)立樣本，用±s表示計(jì)量資料，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葉下珠提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

各組大鼠MCAO 造模成功后，3 個(gè)時(shí)間段各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）；腦缺血24 h 后葉下珠提取物低、高劑量組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分雖低于為MCAO 組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2.67±0.41）、（2.65±0.39）vs.（2.92±0.33）；F低=0.543，F(xiàn)高=0.672；t低=2.045，t高=1.759；P均>0.05］；隨 著 腦 缺 血 時(shí) 間的延長(zhǎng)，48 h后MCAO組評(píng)分有增高趨勢(shì)，但葉下珠提取物低、高劑量組與其相比均有顯著性下降［（2.34±0.34）、（2.30±0.34）vs.（3.09±0.34）；F低=0.013，F(xiàn)高=0.155；t低=5.449，t高=5.314；P均<0.05］，而到了72 h，整體有下降趨勢(shì)，尤其葉下珠提取物低、高劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（1.59±0.29）、（1.31±0.35）vs（2.67±0.31）；F低=0.104，F(xiàn)高=0.002；t低=7.111，t高=7.789；P均<0.01］。提示葉下珠可有效保護(hù)大鼠腦缺血的損傷，劑量依賴性不大，見圖1。

圖1 葉下珠提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分Fig 1 Neurological function score of Phyllanthus urinaria extract in rats

2.2 葉下珠提取物對(duì)大鼠腦梗死面積的影響

手術(shù)造模后，MCAO 組和給藥組大鼠的腦梗死面積百分比明顯增加，表明模型成功。而大鼠腦缺血72 h 后，葉下珠提取物低、高劑量組大鼠的腦梗死面積百分比明顯低于MCAO 組，［（21.21±2.78）、（20.72±2.75）vs.（34.73±3.19）；F低=0.04，F(xiàn)高=0.06；t低=25.875，t高=12.663；P均<0.01］。結(jié)果提示，葉下珠能有效降低實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠模型腦梗死面積來保護(hù)的腦神經(jīng)系統(tǒng)。葉下珠提取物高劑量大鼠的腦梗死面積的百分比雖略低于低劑量組，但兩組無顯著性差異（P>0.05），見圖2。

圖2 葉下珠提取物對(duì)大鼠腦梗死面積的影響Fig 2 Effect of Phyllanthus urinaria extract on cerebral infarction area in rats

2.3 葉下珠提取物對(duì)大鼠腦組織SOD、NO、eNOS水平的影響

腦缺血72 h 后，假手術(shù)組大鼠腦組織SOD、NO、eNOS 水平分別為（219.10±9.766）、（40.41±3.44）、（18.21±3.16），模型組大鼠腦組織SOD、NO、eNOS 水平分別為（142.09±4.36）、（84.61±4.14）、（58.80±3.15），模型 組與假 手術(shù)組 相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FSOD=3.45、FNO=0.628、Fe?NOS=0.066；tSOD=24.83、tNO=-42.44、teNOS=-28.41，P均<0.05），提示腦缺血模型成功；與模型組比較，PuL 低、高劑量的SOD 水平明顯升高［（173±3.99）、（180.31±5.36）vs.（142.09±4.36）；F低=0.173，F(xiàn)高=0.309；t低=-13.368，t高=-30.605；P均<0.05］；PuL 低、高 劑 量 的NO 水 平有一定的下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PuL 低、高劑量的eNOS 水平明顯降低［（29.91±3.48）、（26.93±4.77）vs.（58.80±3.15）；F低=0.102，F(xiàn)高=1.453；t低=17.449，t高=18.121；P均<0.05］，縱 觀PuL 兩個(gè)劑量組SOD、NO、eNOS 水平，高劑量組略好于低劑量組，但兩組無顯著性差異。葉下珠能抗氧化應(yīng)激來保護(hù)腦細(xì)胞損傷，見圖3。

圖3 各組大鼠腦組織SOD、NO、eNOS 水平Fig 3 Levels of SOD，NO and eNOS in brain tissue of rats in each group

2.4 葉下珠提取物對(duì)大鼠腦組織活化caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)情況

各組大鼠腦缺血72 h 后，免疫熒光染色后，以異硫氰酸熒光素特異性標(biāo)記發(fā)光，caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為綠色熒光，顯微鏡下可以看出，圖4A 為假手術(shù)組大鼠腦組織可見零散的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞（3.03±0.59），而圖4B為MCAO組、圖4C為PuL低劑量、圖4D為高劑量組的大鼠腦組織caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為（40.30±4.42）、（26.82±4.75）、（21.11±4.17），比假手術(shù)組顯著性升高（FMCAO=42.435、F低=9.208、F高=33.373；tMCAO=-26.408、t低=-15.683、t高=-13.553，P均<0.01）；與MCAO 組 相 比，PuL 低、高劑量組大鼠腦組織caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（26.82±4.75）、（21.11±4.17）vs.（40.30±4.42）；F低=0.174、F高=0.247；t低=6.573、t高=9.982，P低<0.05、P高<0.01］，提示：葉下珠干預(yù)后可抑制cas?pase-3 執(zhí)行凋亡蛋白，來阻止神經(jīng)細(xì)胞的增殖，見圖4。

圖4 各組大鼠腦組織活化caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（免疫熒光染色，×200）Fig 4 Count of activated caspase-3 positive cells in brain tissue of rats in each group（immunofluorescence staining，× 200）

2.5 葉下珠提取物對(duì)大鼠腦組織PI3K、AKT 蛋白表達(dá)的影響

各組大鼠腦缺血72 h 后，圖5B 為MCAO 組大鼠腦組織的PI3K、AKT 蛋白表達(dá)分別是（0.64±0.17）、（0.58±0.13），與圖5A 假手術(shù)組大鼠腦組織的PI3K、AKT 蛋白表達(dá)（1.19±0.15）、（1.61±0.24）相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FPI3K=0.016、FAKT=1.594；tPI3K=6.269、tAKT=11.351，P均<0.05）；圖5C 和圖5D為PuL低、高劑量組大鼠腦組織的PI3K、AKT 蛋白表達(dá)分別是（0.81±0.18）、（0.95±0.19）；（1.27±0.17）、（1.05±0.14）均 比MCAO 組 大 幅 度 升 高，其 中，PuL 高劑量組大鼠腦組織的PI3K 蛋白表達(dá)與MCAO 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.133，t=-3.192，P<0.05）；而PuL 低 劑 量 組 大 鼠 腦 組 織的AKT 蛋白表達(dá)與MCAO 組相比有顯著性差異（F=0.435，t=-8.835，P<0.05）。提示葉下珠能抑制大腦神經(jīng)元的凋亡，通過抗凋亡使神經(jīng)元細(xì)胞存活，見圖5。

圖5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT 蛋白表達(dá)水平Fig 5 Expression levels of PI3K and Akt proteins in brain tissue of rats in each group

3 討論

腦血管疾病正逐年升高，缺血性腦損傷為常見病之一，發(fā)病后往往供血?jiǎng)用}功能異常、導(dǎo)致腦組織供血不足［11］。當(dāng)前，關(guān)于傳統(tǒng)草藥應(yīng)用于減輕缺血性腦損傷報(bào)道頗多，這表明傳統(tǒng)草藥有一定的優(yōu)勢(shì)在該領(lǐng)域。通過改善腦循環(huán)，保護(hù)神經(jīng)元，清除自由，減少腦缺血繼發(fā)性反應(yīng)［12］。本研究通過葉下珠提取物干預(yù)腦缺血大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠神經(jīng)功能損害在腦缺血24、48、72 h 3 個(gè)時(shí)間段都比MCAO 組低，提示腦損傷后機(jī)體隨著時(shí)間的推移可能會(huì)產(chǎn)生自我清除損傷使神經(jīng)功能恢復(fù)，但從結(jié)果中顯示葉下珠提取物干預(yù)后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)清除的能力都比MCAO 組大鼠強(qiáng)，并且腦梗死面積百分比也明顯降低，說明葉下珠可能助推機(jī)體自我清除損傷功能來保護(hù)大鼠缺血性腦卒中后的腦細(xì)胞、加速神經(jīng)功能恢復(fù)以及降低腦梗死面積。

腦缺血損傷發(fā)生后，發(fā)生許多病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，比如炎癥反應(yīng)造成的損害，氧化應(yīng)激造成的損害以及細(xì)胞凋亡的開始。這些因素會(huì)相互影響并相互作用，最終形成惡性循環(huán)誘導(dǎo)環(huán)，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。也是臨床治療過程的主要困難所在。eNOS 是血管中NO 的主要亞型和主要來源，其缺乏會(huì)導(dǎo)致血管疾病和各種病理生理疾?。?3］。高水平的一氧化氮可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后細(xì)胞凋亡的增加可能與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，表現(xiàn)為抗氧化酶SOD 活性的水平減少［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予葉下珠提取物干預(yù)MCAO 模型大鼠后，大鼠腦組織中NO、eNOS、SOD 含量得到一定的改善，提示葉下珠提取物可能在氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮了一定的作用，改善大鼠腦缺血損傷后的氧化應(yīng)激損傷，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡來保護(hù)腦缺血損傷。

腦缺血損傷形成中央缺血區(qū)，缺血區(qū)的腦組織可能會(huì)遭受程序性死亡，并增加腦部損傷的程度。caspase-3 也是一種重要的蛋白酶，如果在腦缺血損傷的急性期，它就成為促進(jìn)細(xì)胞凋的作用，并可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；而在腦缺血損傷恢復(fù)期時(shí)，它則有抑制神經(jīng)細(xì)胞元的增長(zhǎng)作用，并防止受傷后腦功能的再生恢復(fù)［15］。又有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，無論人還是大鼠發(fā)生腦缺血損傷時(shí)，其腦組織中的caspase-3 表達(dá)會(huì)有上調(diào)趨勢(shì)［16］。所以Caspase-3 已被確定為引發(fā)細(xì)胞死亡的重要介體。當(dāng)cas?pase-3 被激活時(shí)，腦組織細(xì)胞就會(huì)不由自主的發(fā)生凋亡。又發(fā)現(xiàn)阻斷或抑制其caspase-3 高表達(dá)藥物作用腦梗死大鼠模型中，已發(fā)揮出了明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)［17］。本研究實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光手段，觀察大鼠腦組織的caspase-3 表達(dá)是否有細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，腦缺血72 h 后，除假手術(shù)組外，其他3 組的caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯增高，但經(jīng)過葉下珠提取物干預(yù)后，caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)比MCAO 組大鼠大大降低，說明葉下珠可能抑制caspase-3 的表達(dá)來阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)腦缺血后損傷。

Akt 是磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）下游作用的蘇氨酸激酶，它依賴PI3K 途徑來發(fā)揮腦損傷后腦細(xì)胞存活，PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路可防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并對(duì)出血和缺血性中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此PI3K 和Akt 是加速細(xì)胞增殖和抗凋亡的功能，有研究表明，此信號(hào)通路無論是在腦還是在心和腎的缺血性損傷都有關(guān)鍵作用［18］。此外，PI3K 和Akt 在腦缺血和缺氧性腦損傷方面，發(fā)揮保護(hù)腦組織和神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要作用［19］。本研究結(jié)果表明，腦缺血損傷后，除假手術(shù)外，其余組大鼠的AKT、PI3K 蛋白表達(dá)不同程度的降低，尤其MCAO 組最嚴(yán)重，而經(jīng)過葉下珠提取物作用后的大鼠腦組織中AKT、PI3K 蛋白表達(dá)有很大的改善，相比MCAO 組大鼠顯著升高。提示，葉下珠得以保護(hù)腦缺血是通過減少細(xì)胞凋亡的作用可能通過激PI3K-Akt 信號(hào)通路得以實(shí)現(xiàn)的。

綜上，傳統(tǒng)醫(yī)藥對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)逐漸關(guān)鍵，本研究從抗氧化方面入手，結(jié)果顯示，葉下珠雖然有腦缺血損傷的幾個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)有了一定調(diào)節(jié)的作用，但范圍太寬，涉及更深更細(xì)的如基因調(diào)控等機(jī)制尚未闡明，因此是本研究的不足，希望可以進(jìn)一步深挖、不斷的驗(yàn)證其起主導(dǎo)的關(guān)鍵方面，將擴(kuò)大此領(lǐng)域的內(nèi)容。也為葉下珠今后應(yīng)用臨床提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

溫小龍：調(diào)研整理文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)研究方案及論文框架，起草論文；李駿鵬、劉鑫鑫、李宗慧、熊蕓雲(yún)：參與研究，實(shí)施研究過程，采集整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；虞道銳：提出研究選題，獲取研究經(jīng)費(fèi)，技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)性支持。