王瑞琪，劉辰鵬，姚宏紀(jì)，熊婧妍，李國玉，張 勇

（1. 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?， 571199；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱

150076）

隨著抗生素耐藥問題日趨嚴(yán)峻，細(xì)菌感染對(duì)人類健康的威脅越來越大。開發(fā)新型抗菌藥物對(duì)于緩解抗生素耐藥問題及臨床細(xì)菌感染治療壓力迫在眉睫，尤其針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌［1］。革蘭氏陰性細(xì)菌治療過程中除了抑制或殺滅細(xì)菌外，臨床上還面臨著細(xì)菌殺滅過程中釋放的內(nèi)毒素引起的炎癥因子風(fēng)暴等問題［2］，如敗血癥的治療［3］。設(shè)計(jì)新型具有殺菌和中和內(nèi)毒素雙重功能的藥物是解決革蘭氏陰性細(xì)菌感染治療過程面臨的內(nèi)毒素問題的有效途徑之一。

LBP（86-99）（RVQGRWKVRASFFK）為LPS（內(nèi)毒素）結(jié)合蛋白，能夠與血清中內(nèi)毒素結(jié)合，發(fā)揮中和內(nèi)毒素的作用，但其對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性較弱［4］。HLF（1-11）（GRRRRSVQWCA）為人源的乳鐵蛋白多肽，無毒性，穩(wěn)定性好，抗菌譜廣，但無內(nèi)毒素中和效果［5］。本研究通過GGGS 的4 肽Linker 實(shí)現(xiàn)LBP（86-99）與HLF（1-11）多肽的雜合，得到具有高抗菌活性和高效內(nèi)毒素中和作用的新型雜合抗菌LLH，為新型抗革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)提供新思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 大 腸 桿 菌Escherichia coli（E. coli）ATCC 25922，E. coliATCC DH5α 由 本 實(shí) 驗(yàn) 室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 酵母浸粉，胰蛋白胨，瓊脂，NaCl 等試劑購自于北京索萊寶科技有限公司；顯色基質(zhì)鱟試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司；主要儀器有海爾生物安全柜（HR900-IIA2）；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱（INNOVA44R），多功能酶標(biāo)儀（Syn?ergyHTX），離心機(jī)等。

1.2 方法

1.2.1 雙功能雜合肽的設(shè)計(jì)和合成 LBP（86-99）（RVQGRWKVRASFFK）為具有中和內(nèi)毒素功能的多肽，但抗菌活性較弱；HLF（1-11）（GRRRRS?VQWCA）為人源的乳鐵蛋白多肽，具有一定的廣譜抗菌活性，抗菌活性較弱，不具有中和內(nèi)毒素功能。通過GGGS 4 肽Linker 進(jìn)行偶聯(lián)設(shè)計(jì)出新型的雜合肽LLH，見表1。各多肽均由生工生物工程（上海）股份有限公司采用固相合成法合成，純度>98%。采用EMBOSS 和ExPASy 生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)各多肽進(jìn)行理化結(jié)構(gòu)參數(shù)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定 最小抑菌濃度測定方法參考前期研究［6］，具體如下：合成后多肽和陽性藥氨芐青霉素（Amp）用無菌LB 液體培養(yǎng)基配制成濃度為256 μmol/L 的母液，并進(jìn)行2 倍比稀釋。取50 μL 系列不同濃度的多肽溶液和Amp 溶液加入無菌96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度3 個(gè)平行，以無菌LB 液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，制備MIC 板。E. coliATCC 25922 和E. coliATCC DH5α 采 用LB 液 體 培 養(yǎng) 基培養(yǎng)，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4，將大腸桿菌菌液制備成濃度為0.5 麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，用預(yù)熱（37 ℃）無菌LB 液體培養(yǎng)基1 000 倍稀釋，向每個(gè)制備好的MIC 板樣品孔中加50 μL 菌懸液（初始菌濃度約為1.0×105cfu/mL），37 ℃恒溫孵育16～18 h，觀察并記錄MIC 結(jié)果。并對(duì)各處理孔的菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋后，每個(gè)梯度稀釋液取50 μL 涂布于LB 固體培養(yǎng)基，3 個(gè)重復(fù)，37 ℃恒溫孵育16～24 h，直至長出菌落，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以多肽處理孔中菌落數(shù)低于初始接種量的99.9%的培養(yǎng)孔所對(duì)應(yīng)的最低濃度為MBC。

1.2.3 殺菌動(dòng)力學(xué)曲線測定 同1.2.2 制備E. coliATCC 25922 和ATCC DH5α 的1.0×105cfu/mL 濃度的菌懸液。取50 μL 菌懸液至每個(gè)96 孔板的培養(yǎng)孔中，并分別加入終濃度為1×，2×，4×MIC 的LLH 雜合肽溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育。同時(shí)，加入相同體積的LB 培養(yǎng)基和2×MIC 終濃度的Amp 作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照處理。分別在0、1、2、4、6、12 h時(shí)間點(diǎn)取樣涂布LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h，統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.2.4 內(nèi)毒素中和實(shí)驗(yàn) 樣品制備：如1.2.2 制備E.coliATCC 25922 菌懸液，終濃度為1.0×105cfu/mL（三角瓶250 ℃干烤2 h 去除熱原，其它耗材均采購無熱原耗材）。向96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入90 μL菌懸液，并加入10 μL 一定濃度的LLH 雜合肽，使終濃度為4×MIC，加入無熱原等體積生理鹽水和2×MIC Amp 為對(duì)照處理。以不接種細(xì)菌和藥物，加入等體積無熱原生理鹽水組為空白對(duì)照組。每組6 個(gè)復(fù)孔，37 ℃靜置孵育處理2 h。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測：每個(gè)處理組選擇3 個(gè)平行復(fù)孔，收集菌液上清，用于內(nèi)毒素水平測定。其檢測原理如下：鱟試劑為鱟科動(dòng)物東方鱟的血液變形細(xì)胞溶解物的冷凍干燥品，細(xì)菌內(nèi)毒素能夠激活鱟試劑中的C 因子，激活凝固酶原形成凝固酶，進(jìn)而分解顯色基質(zhì)產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA），pNA 與偶氮化試劑偶聯(lián)形成pNA 偶氮化物（λ=545 nm）。在一定時(shí)間內(nèi)，pNA 偶氮化物的生成量與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)。具體測定方法和操作步驟參考顯色基質(zhì)鱟試劑盒（T7571，索萊寶）。

細(xì)菌數(shù)量檢測：每個(gè)處理組選擇3 個(gè)平行復(fù)孔，用于菌落平板計(jì)數(shù)，檢測培養(yǎng)液中活菌數(shù)量，評(píng)價(jià)LLH 的抗菌活性。

1.2.5 溶血性測定 LLH 雜合肽細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)通過多肽對(duì)兔紅細(xì)胞溶血性進(jìn)行測定，參考方法如下。將LLH 雜合肽溶解于無菌生理鹽水中，配置成濃度為230 μmol/L（800 μg/mL）的母液，2 倍倍比稀釋至濃度為0.1 μg/mL。通過兔耳緣靜脈采集5 mL 血液，4 ℃，1 500 r/min，離心5 min，去血清，收集紅細(xì)胞，無菌生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3 次，至上清無色透明。制備8%紅細(xì)胞懸浮液，取100 μL 紅細(xì)胞懸浮液和LLH 雜合肽系類濃度溶液加入96 孔板，37 ℃孵育處理1 h，1 500 r/min 離心5 min，吸取上清至ELISA 酶標(biāo)板檢測540 nm 下紫外吸光值。無菌生理鹽水和0.1% Triton X-100 分別為0%和100%溶血對(duì)照實(shí)驗(yàn)。溶血程度計(jì)算公式如下：

溶血度（%）=［（Abs540nm雜合肽LLH－Abs540nm生理鹽水）／（Abs540nm0.1% Triton X-100－Abs540nm生理鹽水）］×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析和制圖，不同處理組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用Two-way ANOVA 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 多肽設(shè)計(jì) -

以HLF 和LBP 為 母 體 肽，通 過GGGS 4 肽Linker 實(shí)現(xiàn)LBP 與HLF 多肽雜合，設(shè)計(jì)獲得LBPLinker-HLF（LLH）雜合肽。相關(guān)多肽的分子量、電荷數(shù)、等電點(diǎn)，兩親性和疏水性參數(shù)見表1。相對(duì)于母體肽HLF，雜合肽LLH 所攜帶電荷數(shù)增加至+9，兩親性指數(shù)增加至45.33，另外，疏水參數(shù)GRA?VY 值降低。

表1 多肽序列及理化參數(shù)Tab 1 Polypeptide sequence and physicochemical parameters

2.2 LLH 雜合肽二級(jí)結(jié)構(gòu)特征

通過EMBOSS/garnier 軟件GOR 法對(duì)LLH 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，LLH 主要呈現(xiàn)β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，見圖1A；通過EMBOSS/Pepwin?dowall 分析序列疏水性情況，結(jié)果表明，LLH 的10aa-20aa 肽段呈現(xiàn)較強(qiáng)的疏水性，兩端呈現(xiàn)親水特征，見圖1B。

圖1 LLH 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和疏水性預(yù)測Fig 1 Prediction of LLH secondary structure and hydro?phobicity

2.3 LLH 的抗菌作用

選 擇2 株E. coli菌 株（ATCC 25922，ATCC DH5α）對(duì)LBP（86-99）和HFL（1-11）抗大腸桿菌活性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如表2 所示，LBP（86-99）和HFL（1-11）均表現(xiàn)一定的抗大腸桿菌活性，其對(duì)ATCC 25922 的MIC 分別為16 μmol/L 和64 μmol/L，而只有LBP（86-99）對(duì)ATCC DH5α 表現(xiàn)出一定的抗菌活 性，MIC 為8 μmol/L。 雜 合 抗 菌 肽LLH 對(duì)ATCC 25922 和ATCC DH5α 的MIC 分 別 為4μmol/L 和4 μmol/L，相對(duì)于母體肽，抗菌活性明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)MBC 進(jìn)行測定，LLH 雜合肽抗大腸桿菌的MBC 值均是MIC 值的1～2 倍，LLH 雜合肽具有較強(qiáng)的殺菌作用。與傳統(tǒng)抗生素Amp 相比，綜合MIC 和MBC 測定結(jié)果，雜合肽LLH 活性優(yōu)于Amp，見表2。

表2 雜合肽LLH 的MIC 和MBC (μmol/L)Tab 2 MIC and MBC of heterozygous peptide LLH (μmol/L)

2.4 LLH 的殺菌動(dòng)力特征

通過體外殺菌-時(shí)間曲線探究LLH 雜合肽在不同濃度和時(shí)間下的殺菌能力進(jìn)行檢測，選擇大腸桿菌ATCC 25922 和ATCC DH5α 作為代表菌株。經(jīng)活菌計(jì)數(shù)檢測E. coliATCC 25922 和E. coliATCC DH5α 初 始接種量 為（4.54±0.09）log10cfu/mL 和（4.91±0.11）log10cfu/mL，未經(jīng)LLH 干預(yù)處理的，37oC 孵育12 h 后，E. coliATCC 25922 和E. co?liATCC DH5α 分 別 增 加 至（8.27±0.10）log10cfu/mL 和（8.41±0.09）log10cfu/mL。 經(jīng)1×MIC，2×MIC、4×MIC 的LLH 處 理1 h 后，E. coliATCC 25922 菌落數(shù)分別減少了1.1、1.5、2.2 log10cfu/mL，而E. coliATCC DH5α 菌落數(shù)分別減少了0.6、1.4、1.9 log10cfu/mL，由此表明，1 h 處理后，90%以上的E. coli均被殺死。處理12 h 后，E. coliATCC 25922 菌落數(shù)分別減少了3.2、3.5、3.5 log10cfu/mL，見圖2A，而E. coliATCC DH5α 菌落數(shù)分別減少了3.5、3.9、3.9 log10cfu/mL。相對(duì)于未經(jīng)LLH 處理組的LB medium 組，4×MIC 的LLH 組菌落數(shù)下降了7.2 log10cfu/mL。由此可見，LLH 對(duì)E. coli表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌活性，且持續(xù)12 h 未見反彈，見圖2。

圖2 LLH 雜合肽殺菌動(dòng)力學(xué)曲線Fig 2 Bactericidal kinetic curve of LLH heterozygous peptide

2.5 LLH 雜合肽中和內(nèi)毒作用

選擇E.coliATCC 25922 作為受試菌，進(jìn)一步研究LLH 雜合肽殺菌過程對(duì)內(nèi)毒素釋放的影響。4×MIC 的LLH 雜合肽處理2 h 后，E. coliATCC 25922 數(shù) 量 顯 著 下 降3.5 log10cfu/mL，2×MIC 的Amp 菌落數(shù)下降2.59 log10cfu/mL，提示4×MIC LLH 雜合肽和2×MIC Amp 均表現(xiàn)出了一定的殺菌作用。

相同處理?xiàng)l件，筆者通過對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)液上清中內(nèi)毒素水平進(jìn)行測定，結(jié)果表明，4×MIC LLH 雜合肽處理組相對(duì)于正常組，內(nèi)毒素檢測水平顯著降低，而2×MIC Amp 處理組內(nèi)毒素水平顯著高于4×MIC LLH 雜合肽處理組。與正常組相比，2×MIC Amp 處理組的內(nèi)毒水平也顯著升高，見圖3。

圖3 LLH 雜合肽對(duì)內(nèi)毒素的中和作用Fig 3 Neutralization effect of LLH hybrid peptide on endotoxin

2.6 LLH 雜合肽的溶血性

筆者進(jìn)一步探究了LLH 雜合肽對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的破壞而引起的溶血性情況。結(jié)果如圖，0～115 μmol/L（400 μg/mL）的不同濃度LLH 雜合肽溶血性程度都低于1%，低于200 μg/mL 濃度時(shí)，溶血性低于0.1%，見圖4。因此，LLH 雜合肽對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞不具有毒性，可應(yīng)用于哺乳動(dòng)物體內(nèi)殺菌，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖4 LLH 的溶血性Fig 4 Hemolysis of LLH

3 討論

抗生素耐藥問題一直以來都是臨床抗感染治療面臨的重要挑戰(zhàn)，尤其是革蘭氏陰性菌的感染，對(duì)人類健康造成極大威脅［7，8］。為了緩解傳統(tǒng)抗生素耐藥性壓力，新型的抗耐藥性、高活性、低毒性的抗菌藥物開發(fā)刻不容緩。抗菌肽作為具有獨(dú)特殺菌機(jī)制，高效快速殺菌活性及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)［9］，被認(rèn)為是潛在新型抗菌藥物，已被廣泛關(guān)注并寄予厚望。

對(duì)于革蘭氏陰性菌感染，尤其以敗血癥，膿毒癥為代表相關(guān)疾病，其治療過程中單純的殺菌還不能滿足臨床治療目的［10，11］。革蘭氏陰性細(xì)菌生長或抗菌藥物殺菌的過程往往會(huì)伴隨內(nèi)毒素的釋放，進(jìn)而誘發(fā)炎癥因子風(fēng)暴，誘發(fā)相關(guān)疾病，如敗血癥，嚴(yán)重威脅患者生命［12］。殺滅細(xì)菌和中和內(nèi)毒是革蘭氏陰性細(xì)菌治療面臨的重要挑戰(zhàn)。本研究基于此雙重功能，通過GGGS 柔性linker 實(shí)現(xiàn)兩個(gè)分別具有內(nèi)毒素中和作用和快速殺菌作用的多肽雜合，實(shí)現(xiàn)雙重功能有效發(fā)揮，并不具有顯著溶血性。

基于小肽柔性Linker 為鉸鏈連接兩個(gè)具有功能活性的多肽或蛋白質(zhì)亞基實(shí)現(xiàn)雙重功能的發(fā)揮是新型多功能多肽或蛋白藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的效手段［12-14］。這些Linker 多以（GGGGS）n 或（G）n 形式，被廣泛用于不同功能的多肽或蛋白的融合構(gòu)建，實(shí)現(xiàn) 多 種 功能 的 發(fā) 揮，如LHP7［14］和Syn-GNU7 雜 合肽［12］?？紤]到母體肽均為短的多肽，盡可能減少柔性鉸鏈區(qū)Linker 序列對(duì)母體肽結(jié)構(gòu)和功能影響，筆者選擇GGGS 4 肽Linker。結(jié)果表明，這種雜合構(gòu)建的新型LLH 雜合肽具有內(nèi)毒素中和作用和更強(qiáng)的抗菌活性。結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了，通過柔性Link?er 實(shí)現(xiàn)多功能多肽或蛋白的設(shè)計(jì)策略是可行的。

新型雜合抗菌肽LLH 表現(xiàn)出類似LBP（86-89）的內(nèi)毒素中和作用（LPS 結(jié)合作用），同時(shí)，表現(xiàn)出顯著的抗E. coli活性（MIC，4～8 μmol/L），且強(qiáng)于母體肽LBP 和HLF。通過二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，LLH 雜合肽正電荷數(shù)增加至+9，兩親性和疏水性位于兩母體肽之間。諸多研究表明，抗菌肽的正電荷跟其抗菌活性密切相關(guān)，正電荷越多，其與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合作用可能越強(qiáng)［15，16］。同時(shí)，兩親性和疏水性的平衡也是抗菌肽抗菌活性發(fā)揮的關(guān)鍵因素［15］。因此，筆者推測，LLH 雜合肽抗菌活性的增強(qiáng)可能與其正電荷的增加及兩親性和疏水性的平衡有關(guān)，具體機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

溶血性是反映藥物對(duì)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞毒性的重要參數(shù)?？咕拈_發(fā)為臨床抗菌藥物的限制因素之一就是細(xì)胞毒性［17］。一些抗菌肽雖然具有廣泛的抗菌活性和獨(dú)特抗菌特性，但其無差別破壞細(xì)胞膜易引起溶血［18］?？茖W(xué)家可以通過對(duì)抗菌肽進(jìn)行改造，如增加柔性Linker［19］、側(cè)鏈［20］、凈電荷［21］、疏水性［22］等方式，提高抗菌肽的殺菌活性同時(shí)降低溶血性。筆者通過柔性Linker 連接實(shí)現(xiàn)的中和內(nèi)毒素和增效抗菌活性的新型雙功能雜合肽LLH 并未表現(xiàn)出顯著的溶血性，表明臨床應(yīng)用具有一定的安全性。

總之，借助柔性Linker GGGS 多肽，實(shí)現(xiàn)了母體肽LBP（86-99）和HFL（1-11）中和內(nèi)毒素和高效抗菌活性雙重功能的發(fā)揮，為新型抗大腸桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌感染藥物的設(shè)計(jì)提供思路和參考。同時(shí)，LLH 表現(xiàn)出顯著中和內(nèi)毒素作用，強(qiáng)大快速的抗大腸桿菌活性（MIC，4～8 μmol/L）和無溶血性，提示其是潛在用于治療大腸桿菌感染的抗菌肽。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張勇：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)的處理，文章的撰寫；李國玉：負(fù)責(zé)文稿審校，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；王瑞琪、劉辰鵬、姚宏紀(jì)、熊婧妍：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，數(shù)據(jù)的收集。