林章英，汪 元，黃傳兵，張皖東，王桂珍，陳瑞蓮，龔 雪

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病一科，安徽 合肥 230031）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種由于關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)慢性炎癥及免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致靶器官損傷為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，臨床上主要表現(xiàn)為骨及關(guān)節(jié)軟骨的破壞，血管炎及血瘀狀態(tài)等［1，2］。RA的基本病理改變?yōu)榛ぱ住⒀荇韬脱苎椎鹊男纬?，與患者體內(nèi)高凝狀態(tài)、血管內(nèi)皮增生、血小板異常升高等密切相關(guān)。RA 屬于“尪痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為久病必瘀，瘀血是導(dǎo)致本病纏綿難愈重要原因，瘀血為RA 的主要病因與病理產(chǎn)物，同時(shí)又作為其主要的發(fā)病機(jī)制貫穿在RA 疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為脾虛濕盛、氣血虧虛、痰瘀互結(jié)是RA 的基本病機(jī)，提出“益氣健脾通絡(luò)”的治療方法，創(chuàng)制新風(fēng)膠囊（Xinfeng Capsule，XFC）運(yùn)用于臨床，療效顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者體內(nèi)普遍存在高凝狀態(tài)［2］，而XFC 可能通過(guò)抑制異?；罨腘F-κB 通路，升高抑炎因子白細(xì)胞介素-10（interleu?kine-10，IL-10）的水平，降低致炎因子IL-17、IL-6 的水平，調(diào)節(jié)了機(jī)體細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而使RA 患者體內(nèi)的部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thrombo?plastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、D 二聚體（d-dimer，D-D）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)BG）、血小板（platelet，PLT）、血小板激活因子、血小板活化因子-乙酰水解酶趨向新的一種平衡狀態(tài)，進(jìn)而改善RA 患者血瘀狀態(tài)［3］。同時(shí)我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)RA 患者中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）表達(dá)水平增加，且與疾病活動(dòng)密切相關(guān)［4］。VEGF 是一種極為重要的促血管生成因子，可與滑膜血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合，促進(jìn)滑膜血管新生和血管翳形成，增加血管通透性和炎性因子的釋放［5］，從而參與RA 血瘀病理進(jìn)程。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/絲-蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine kinase，AKT）信號(hào)通路與微血管損傷及血管新生的發(fā)生機(jī)制有關(guān)［6］，是VEGF 下游信號(hào)通路中極其重要的組成部分，可在血管生成中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用，過(guò)表達(dá)PI3K或AKT 能誘導(dǎo)廣泛的新血管生成及增大已存在的血管［7］，與RA 患者的血瘀狀態(tài)密切相關(guān)。而miR-126 是血管新生信號(hào)通路中的正向調(diào)節(jié)因子，過(guò)表達(dá)miR-126 可激活VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路，增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)滑膜血管翳形成［8］。本文通過(guò)觀察miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路的變化，探討XFC 改善RA 血瘀狀態(tài)的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇60 例就診于我院風(fēng)濕免疫科住院的RA患者，住院時(shí)間為2020 年5～12 月。其中男性23例，女性37 例，年齡27～70 歲，病程最短1 年，最長(zhǎng)23 年。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為XFC 治療組30 例和來(lái)氟米特（LEF）對(duì)照組30 例。兩組在性別、年齡、病程方面比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究已獲得安徽省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者已簽訂知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照2010 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同提出的RA 分類標(biāo)準(zhǔn)［9］，總分≥6 分可診斷為RA。

1.3 血瘀證癥狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)按照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定了“血瘀證癥狀分級(jí)量化表”［10］。將關(guān)節(jié)刺痛、唇色、舌質(zhì)、脈象、皮下瘀斑、肌膚甲錯(cuò)根據(jù)不同程度按照正常、輕、中、重，分別計(jì)為0、1、2、3 分。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）符合活動(dòng)期診斷標(biāo)準(zhǔn)者；（3）年齡18～75 歲；（4）曾經(jīng)使用非甾體類抗炎藥及慢作用抗風(fēng)濕藥的患者，須停藥3 個(gè)月以上才可入組。（5）自愿簽署知情同意書(shū)。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；（2）合并有嚴(yán)重疾病以及嚴(yán)重關(guān)節(jié)外表現(xiàn)；（3）精神異常的患者；（4）孕婦或哺乳期女性；（5）被研究者認(rèn)為不宜進(jìn)行此項(xiàng)臨床試驗(yàn)者。

1.6 治療方案

治療組予以口服新風(fēng)膠囊（3 粒，3 次/d），對(duì)照組予以口服來(lái)氟米特片（1 粒，1 次/d），均連續(xù)服用30 d。兩組患者在研究中可根據(jù)情況使用非甾體消炎止痛藥，但要避免使用免疫抑制劑及治療RA 的其他中成藥。

1.7 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)

D-D、FBG、TT、APTT、PT、PLT、血小板平均體積（mean platelet volume，MPV）、血小板分布寬度（platelet distribution width，PDW）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor，RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic citrulli?nated peptide，CCP）均由安徽省中醫(yī)院檢驗(yàn)中心檢測(cè)。

1.8 ELISA 檢測(cè)血清

按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定VEGF、PI3K、AKT、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、IL-6 和IL-35 水平。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-126

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)miR-126 含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以xˉ±s或者中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用spearman 分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組治療前后血瘀癥狀積分比較

與治療前相比，兩組治療后血瘀癥狀、體征明顯改善（P<0.05～0.01）；與LEF 組治療后相比，XFC 組治療后關(guān)節(jié)刺痛、舌質(zhì)、皮下瘀斑、血瘀總積分明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組治療前后血瘀癥狀積分比較(分，n=30)Tab 1 Comparison of blood stasis symptom score between the two groups before and after treatment (score，n=30)

2.2 兩組治療前后炎癥指標(biāo)、細(xì)胞因子比較

與治療前比較，治療后兩組CRP、ESR、RF、CCP、IL-6、TNF-α 等指標(biāo)均顯著下降，IL-35 顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與LEF 組比較，XFC 組IL-35 治 療 后 較LEF 組 升 高 明 顯，ESR、TNF-α、IL-6 降低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后炎癥指標(biāo)、細(xì)胞因子比較(n=30)Tab 2 Comparison of inflammatory indicators and cytokines between the two groups before and after treatment (n=30)

2.3 兩組治療前后血瘀相關(guān)指標(biāo)比較

與治療前相比，治療后兩組的D-D、FBG、PLT下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），APTT、TT、PT、MPV、PDW 無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與LEF 組相比，XFC 組D-D、FBG、PLT 下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。

表3 兩組治療前后血瘀相關(guān)指標(biāo)比較(n=30)Tab 3 Effects of the two groups on blood stasis related indexes in RA patients (n=30)

2.4 兩組治療前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比較

與治療前相比，兩組治療后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與LEF 組 治 療 后 相 比，XFC 組 治 療 后VEGF、miR-126、PI3K、AKT 水平降低更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表4。

表4 兩組治療前后miR-126、VEGF、PI3K、AKT 的比較(n=30)Tab 4 Effects of the two groups on miR-126，VEGF，PI3K and AKT in RA patients (n=30)

2.5 RA 患者血瘀指標(biāo)與細(xì)胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相關(guān)性分析

RA 患者血瘀總積分與CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 成正相關(guān)，與IL-35 表達(dá)成負(fù)相關(guān)（P<0.05，P<0.01）；D-D與CRP、ESR、CCP、IL-6、VEGF 成 正 相 關(guān)（P<0.05，P<0.01）；FBG 與CRP、CCP、VEGF、PI3K、AKT 成正相關(guān)（P<0.05，P<0.01）；PLT 與CRP、ESR、RF、CCP、TNF-α、IL-6、VEGF、PI3K、AKT成正相關(guān)（P<0.01）；MPV 與PI3K 成負(fù)相關(guān)（P<0.01）；PDW 與CCP 成負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見(jiàn)表5。

表5 血瘀指標(biāo)與細(xì)胞因子、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 相關(guān)性分析（r）Tab.5 Correlation analysis of blood stasis indicators with cytokines，miR-126，VEGF，PI3K and AKT（r）

3 討論

RA 屬于中醫(yī)“歷節(jié)病”、“風(fēng)濕”、“鶴膝風(fēng)”、“白虎病”的范疇，其早見(jiàn)于《素問(wèn)·痹論》，與風(fēng)、寒、濕三氣有關(guān)。而RA 的發(fā)病不僅與風(fēng)寒濕等外感邪氣有關(guān)，與內(nèi)因也有關(guān)系，《醫(yī)宗金鑒·痹癥總括》指出：“脾虛謂氣虛之人病諸痹也”。指出脾氣虧虛，正氣不足，是RA 血瘀形成主要病理基礎(chǔ)，本團(tuán)隊(duì)在臨床實(shí)踐中將“從脾論治”應(yīng)用于臨床，研制出新風(fēng)膠囊治療RA，新風(fēng)膠囊主要由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣四位藥物組成。劉赟等［11］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液的早期干預(yù)，能調(diào)節(jié)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物、血小板的水平，改善微循環(huán)障礙。薏苡仁新芽提取物可以使PI3K/AKT 通路失活，致使細(xì)胞周期延長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡，減少血管新生［12］。同時(shí)，薏苡仁注射液可下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞因子水平表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制纖維蛋白原釋放，同時(shí)可降低促炎細(xì)胞因子IL-1、TNF-α 的表達(dá)水平［13］。雷公藤甲素可抑制血小板的病理性聚集，與此同時(shí)也有調(diào)節(jié)機(jī)體血瘀狀態(tài)的作用［14］。蜈蚣可使小鼠TT、APTT、PT 明顯延長(zhǎng)［15］，改善血瘀狀態(tài)?？v觀全方，XFC 具有健脾化濕、活血通絡(luò)之效，對(duì)RA 血瘀狀態(tài)有明顯療效。

現(xiàn)階段血瘀證發(fā)病機(jī)理尚未完全研究清楚，但多數(shù)研究者認(rèn)為其具體表現(xiàn)為高黏滯狀態(tài)和高凝狀態(tài)，而凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)是判定血瘀證的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)［16-18］。因此，凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)有助于在RA 疾病早期發(fā)現(xiàn)患者血瘀狀態(tài)的改變從而指導(dǎo)臨床選方用藥，更好地延緩RA 患者的疾病進(jìn)展。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)［19］，與正常組比較，RA患者外周血中D-D、FBG、PLT 顯著升高（P<0.01），TT 延長(zhǎng)（P<0.01），RA 患者外周血中凝血與血小板相關(guān)指標(biāo)與臨床癥狀體征、DAS28、疾病活動(dòng)性指標(biāo)成正相關(guān)，因此RA 患者血瘀狀態(tài)的預(yù)防和改善有重要臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，XFC 組可以改善疾病活動(dòng)性指標(biāo)、血瘀癥狀體征，降低血瘀癥狀總評(píng)分、D-D、FBG、PLT（P<0.05，P<0.01）水平。與LEF 組相比，XFC 組治療后降低更明顯（P<0.05，P<0.01），提示新風(fēng)膠囊在緩解RA 患者活動(dòng)的同時(shí)，還可改善其血瘀狀態(tài)。

RA 血瘀狀態(tài)的機(jī)制可能與血管新生及血管翳的形成密切相關(guān)。VEGF 是血管新生的誘導(dǎo)介質(zhì)［20］，是血管翳形成的關(guān)鍵因子。同時(shí)，VEGF 在其下游PI3K-AKT 的信號(hào)級(jí)血管新生中，VEGF 可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂原，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)還可以促進(jìn)間質(zhì)膠原酶分泌，降解細(xì)胞基質(zhì)［21］。PI3K/AKT 作為VEGF 的下游信號(hào)通路，可經(jīng)由PI3K-AKT 下游分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2 和叉頭轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生［22，23］，參與血瘀狀態(tài)的發(fā)成。miR-126 可通過(guò)調(diào)控VEGF 表達(dá)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)功能［24］，促進(jìn)血管新生，與RA 血瘀狀態(tài)密切相關(guān)。同時(shí)，miR-126 可通過(guò)影響PIK3R2 基因，從而調(diào)控PI3K/AKT 信號(hào)通路而發(fā)揮其在血管新生、細(xì)胞增殖、分化遷移等功能［25］。有研究指出在體外實(shí)驗(yàn)中，IL-35 能抑制VEGF 誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、成管及血管生成素2 的分泌［26］。TNF-α 可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附白細(xì)胞，進(jìn)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性物質(zhì)，從而激活凝血系統(tǒng)，抑制纖溶［27］，且TNF 與其受體結(jié)合以后可以影響VEGF的增殖與遷移，影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血管增生水平，導(dǎo)致骨與軟骨的損傷［28］。IL-6 促進(jìn)RA 血管增生 主 要 是 通 過(guò) 與TNF-α、IL-1 及IL-17 的協(xié)同作用而增加VEGF 及CCL28 的表達(dá)［29］。本次研究發(fā)現(xiàn)，RA 患者血瘀總積分、血瘀相關(guān)指標(biāo)與TNF-α、IL-6、IL-35、miR-126、VEGF、PI3K、AKT 均具有相關(guān)性。說(shuō)明RA 患者的血瘀狀態(tài)與miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路及炎癥因子密切相關(guān)。XFC治療后，疾病活動(dòng)性指標(biāo)、miR-126、VEGF、PI3K、AKT、TNF-α、IL-6、D-D、FBG、PLT 水平明顯下降（P<0.01），IL-35 顯著升高（P<0.01），提示XFC 可能對(duì)miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路具有抑制作用，下調(diào)促炎因子IL-6、TNF-α 水平，上調(diào)抑炎因子IL-35 水平，從而降低D-D、FBG、PLT 水平，緩解RA 血瘀狀態(tài)。

綜上所述，miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路的異?；罨cRA 患者的血瘀狀態(tài)密切相關(guān)，XFC 可以改善RA 患者的血瘀狀態(tài)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制miR-126-VEGF/PI3K/AKT 信號(hào)通路的活化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而達(dá)到延緩或抑制血瘀狀態(tài)，減少關(guān)節(jié)病變。本研究?jī)H進(jìn)行了臨床研究，將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以提高結(jié)論的可靠性。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

林章英：完成數(shù)據(jù)采集，分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文等；汪元：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并對(duì)論文提出指導(dǎo)意見(jiàn)；黃傳兵、張皖東、王桂珍、陳瑞蓮、龔雪：參與研究設(shè)計(jì)和研究實(shí)施及收集數(shù)據(jù)。