張玉雙,代安娜,2,丁功濤,2,羅麗,王寶民,劉紅娜,2*,丁波*

1(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730030) 2(生物醫(yī)學(xué)研究中心中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(西北民族大學(xué)),甘肅 蘭州,730030) 3(甘南牦牛乳研究院,甘肅 蘭州,730000)4(甘肅綠能農(nóng)業(yè)科技股份有限公司,甘肅 武威,733000)

牦牛乳富含脂肪(5.5%～7.5%)、蛋白質(zhì)(4.0%～5.9%)和乳糖(4.0%～5.9%)[1],但產(chǎn)量少,受季節(jié)性限制,每個(gè)泌乳期每頭牦牛產(chǎn)乳150～500 kg,僅為傳統(tǒng)奶牛產(chǎn)奶量的1/10[2],極大限制了牦牛乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

我國(guó)大豆產(chǎn)量豐富,大豆含有30%～45%的蛋白質(zhì)及人體所需必需氨基酸[3],豐富的不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質(zhì)和維生素等,具有降血脂、降膽固醇、預(yù)防心血管疾病等功效[4-5]。但豆乳的豆腥味及棉子糖、水蘇糖等脹氣因子[6]難以被消費(fèi)者接受。通過(guò)益生菌發(fā)酵可改善豆乳的風(fēng)味和口感,有助于改善腸道微生物平衡,同時(shí)能降低豆乳低聚糖含量,提高游離異黃酮水平[7]。嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌具有抗菌、抗癌、降低膽固醇和緩解乳糖不耐癥等健康益處[8-9],因此研究選用嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌為益生菌菌株。

目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在益生菌發(fā)酵飲料的工藝優(yōu)化以及產(chǎn)品研發(fā)方面[10-11]，研究表明菌株選擇是獲得足夠酸化率的一個(gè)重要因素。且使用菌株混合培養(yǎng)可以減少發(fā)酵時(shí)間和令人不愉快的味道，然而，關(guān)于益生菌與發(fā)酵劑混合在不同的牦牛乳和豆乳組合中的情況未見(jiàn)報(bào)道。本文以牦牛乳和豆乳為原料,分別選取嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌為益生菌,添加濃縮果汁制備新型發(fā)酵飲料,旨在確定發(fā)酵結(jié)束時(shí)牦牛乳與豆乳的比例和益生菌種類(lèi)對(duì)發(fā)酵飲料理化、微生物和感官特性的綜合影響,并分析4 ℃冷藏期間濃縮果汁對(duì)發(fā)酵飲料活菌數(shù)和感官屬性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳,甘肅華羚;黃豆,黑龍江陽(yáng)光種業(yè)有限公司;濃縮果汁(草莓、梨、桃、藍(lán)莓；固形物含量分別為52、65、60、42°Brix),福建綠泉食品有限公司；商品混合發(fā)酵劑YF-L922 (保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)、益生菌(嗜酸乳桿菌LA-5、副干酪乳桿菌LC-01),科漢森(中國(guó))；乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海北諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N型電子天平、TG16-WS型高速離心機(jī)、DHG—9241A型恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì),北京科偉儀器有限公司;LC-20A Prominence液相色譜儀,日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豆乳的制備[12]

選用粒籽飽滿、光滑圓整的黃豆,豆水比1∶3(g∶mL)于20 ℃浸泡10 h。用大豆干重7倍水磨漿,過(guò)濾備用。

1.3.2 發(fā)酵飲料的制備

分別以100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100的質(zhì)量比混合脫脂牦牛乳與豆乳,85 ℃殺菌30 min,冷卻至40 ℃用發(fā)酵劑YF-L922分別與益生菌LA-5、LC-01組合接種混合脫脂牦牛乳與豆乳(發(fā)酵劑、益生菌各接種0.01%)。(40±0.2)℃恒溫發(fā)酵,pH至4.6±0.02時(shí)發(fā)酵結(jié)束,將產(chǎn)品冷卻至4 ℃。選取益生菌活菌數(shù)最高及感官品質(zhì)最佳的產(chǎn)品,分別添加草莓、梨、桃、藍(lán)莓濃縮果汁(添加量均為12%)、糖(添加量6%),添加完成后將所得4種產(chǎn)品進(jìn)行21 d冷藏。

1.3.3 pH和滴定酸度的測(cè)定

pH值采用pH計(jì)測(cè)定。可滴定酸度參照GB 5009.239—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 乳酸、乙酸含量的測(cè)定

精確稱取乳酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品,用水稀釋并定容至100 mL制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,4 ℃保存。將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水逐級(jí)稀釋成20、40、60、80、100 mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,0.45 μm膜過(guò)濾[13]。將5.0 g樣品用0.05 mol/L H2SO4稀釋至20 mL,均質(zhì),3 000 r/min離心15 min,取上清液經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后分析。條件：色譜柱C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL;波長(zhǎng)254 nm;檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器(UV-detector);流動(dòng)相0.05 mol/L H2SO4。

1.3.5 活菌數(shù)測(cè)定

采用MRS培養(yǎng)基稀釋平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.3.6 感官評(píng)定

選取發(fā)酵飲料第0和第21天貯藏期,由7名訓(xùn)練有素的評(píng)審員進(jìn)行感官分析。取20 mL樣品于白色塑料杯中,溫度4 ℃。采用評(píng)分法進(jìn)行比較。感官參數(shù)為風(fēng)味、口感和外觀。以5分制評(píng)分,0=不可飲用,1=不可接受,2=可接受,3=滿意,4=優(yōu)秀。每個(gè)感官參數(shù)加權(quán)計(jì)算,風(fēng)味權(quán)重6,口感權(quán)重3.5,外觀權(quán)重2[14]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析,并采用Duncan法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05,差異顯著),制圖軟件采用Origin 2017。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)發(fā)酵飲料pH、滴定酸度及乳酸、乙酸含量的影響

pH值和滴定酸度是評(píng)價(jià)發(fā)酵飲料品質(zhì)的重要指標(biāo)[15]。由表1可知,牦牛乳與豆乳比例對(duì)產(chǎn)品的最終滴定酸度有顯著影響(P<0.05),牦牛乳比例越高,滴定酸度越大。

表1 不同處理對(duì)發(fā)酵飲料pH、滴定酸度及乳酸和乙酸含量的影響Table 1 Effect of different treatments on pH, titerable acid, content of lactic acid and acetic acid

圖1 發(fā)酵過(guò)程中不同處理pH值及酸度變化Fig.1 Changes in pH and acidity of different treatments during fermentation

牦牛乳和豆乳的質(zhì)量比為75∶25和50∶50處理組的pH平均下降速率和酸度上升速率最大(P<0.05),發(fā)酵時(shí)間最短(圖1)。發(fā)酵初始時(shí),100∶0處理組的pH降低速率及酸度增加速率較慢,可能是因?yàn)殛笈Ｈ樗峄螽a(chǎn)生的大量無(wú)機(jī)鹽離子與H+結(jié)合增強(qiáng)了產(chǎn)品的緩沖能力[16]。0∶100處理組pH下降速率和酸度增加速率明顯減慢,是因?yàn)槎谷檩^高含量的固形物使形成酸凝膠的速度減慢,與LEE等[17]研究結(jié)果一致。因此牦牛乳中加入豆乳能在一定程度上豐富發(fā)酵飲料的營(yíng)養(yǎng),但豆乳比例過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵底物中干物質(zhì)比例減少,微生物可利用的底物缺乏。

乳酸和乙酸的含量可以賦予發(fā)酵飲料清爽口感[18]。發(fā)酵飲料的最終酸度、乳酸和乙酸含量隨豆乳比例的增加而下降。這可能與豆乳中含有低聚糖、棉子糖和水蘇糖等,pH下降顯著,乳酸菌的生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)[19]。100∶0和75∶25牦牛乳處理中乳酸和乙酸含量較高,是因?yàn)殛笈Ｈ橹械囊恍┦人峋谳^低pH下仍能繼續(xù)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸通過(guò)丙酮酸代謝產(chǎn)生乙酸[19]。如表1所示,以副干酪乳桿菌為益生菌,100∶0、75∶25、50∶50處理組發(fā)酵飲料的平均酸度增加速率明顯大于嗜酸乳桿菌發(fā)酵飲料(P<0.05);當(dāng)牦牛乳添加量<50%時(shí),含嗜酸乳桿菌處理的平均酸度增加速率更大,說(shuō)明副干酪乳桿菌的生長(zhǎng)更依賴于牦牛乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2.2 不同處理對(duì)發(fā)酵飲料活菌數(shù)的影響

益生菌活菌數(shù)對(duì)發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)有較大影響[20]。由表2可知,產(chǎn)品發(fā)酵結(jié)束后,不同處理的副干酪乳桿菌活菌數(shù)均顯著高于嗜酸乳桿菌活菌數(shù)(P<0.05),這是因?yàn)楦备衫胰闂U菌所具有的良好蛋白酶活性,有助于菌體生長(zhǎng)和存活[21]。m(牦牛乳)∶m(豆乳)為75∶25和50∶50時(shí),益生菌活菌數(shù)較高,這可能是因?yàn)殛笈Ｈ橹懈缓途厶?、游離氨基酸和多肽等益生菌所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[22]。過(guò)量的豆乳25∶75、0∶100處理組活菌數(shù)較低,可能是由于發(fā)酵過(guò)程中缺乏益生菌發(fā)酵的乳糖或其他生長(zhǎng)因子。以嗜酸乳桿菌為益生菌的100∶0處理組活菌數(shù)最低(P<0.05),這可能是因?yàn)殛笈Ｈ楹窟^(guò)高,導(dǎo)致保加利亞乳桿菌抑制益生菌的過(guò)度酸化形成H2O2和細(xì)菌素[23]。在益生菌為副干酪乳桿菌 50∶50處理中,益生菌活菌數(shù)最高(P<0.05),說(shuō)明均衡的牦牛乳、豆乳比例對(duì)維持發(fā)酵飲料中的益生菌活菌數(shù)有促進(jìn)作用。

表2 發(fā)酵結(jié)束后的活菌數(shù)Table 2 Number of probiotics after fermentation

2.3 不同處理對(duì)發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

感官屬性是評(píng)價(jià)發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[20]。由表3可知,以嗜酸乳桿菌為益生菌的100∶0處理組風(fēng)味得分最高(P<0.05),以嗜酸乳桿菌為益生菌的100∶0及75∶25處理組外觀得分最高(P<0.05),而益生菌為嗜酸乳桿菌的0∶100處理組感官評(píng)分最低(P<0.05)。豆乳添加量對(duì)發(fā)酵飲料的感官屬性有顯著影響(P<0.05)。豆乳含量過(guò)高時(shí),發(fā)酵飲料的感官評(píng)分較低,這是因?yàn)槎谷橹腥狈σ胰?、雙乙酰等重要的乳制品風(fēng)味物質(zhì)[24];且豆乳中存在芳香化合物2-異丙基-3-甲氧基吡嗪,會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的豆腥味[25]。嗜酸乳桿菌在牦牛乳比例較高(100∶0、75∶25)時(shí)感官可接受性更好,這可能是嗜酸乳桿菌在牦牛乳中產(chǎn)生乙醛和雙乙酰的能力更強(qiáng)導(dǎo)致的[24]。除對(duì)照組外,75∶25、50∶50處理組的樣品感官評(píng)分最高(P<0.05)。由表2可知,以副干酪乳桿菌為益生菌的50∶50處理組活菌數(shù)最高(P<0.05)。綜合發(fā)酵飲料的活菌數(shù)和感官評(píng)定結(jié)果,最終以益生菌為副干酪乳桿菌的50∶50處理組為最佳處理,加入4種濃縮果汁(草莓、梨、桃、藍(lán)莓)貯存21 d。

表3 發(fā)酵結(jié)束后的感官評(píng)定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results after fermentation

2.4 濃縮果汁對(duì)發(fā)酵飲料pH、滴定酸度的影響

如圖2所示,冷藏期間發(fā)酵飲料pH由4.60降至4.30附近,滴定酸度由48 °T升至51 °T,可能是因?yàn)槔洳剡^(guò)程中乳酸菌持續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵飲料酸度上升[21-23]。冷藏21 d后,添加桃濃縮汁處理組的pH最高,最終酸度最低;添加藍(lán)莓濃縮汁的處理組pH最低,最終酸度最高。綜上所述,發(fā)酵飲料中添加的濃縮果汁類(lèi)型對(duì)產(chǎn)品發(fā)酵效果存在影響。

a-pH;b-可滴定酸度S-草莓濃縮汁,P1-梨濃縮汁,P2-桃濃縮汁,B-藍(lán)莓濃縮汁;T-以50∶50牦牛乳與豆乳比為發(fā)酵基質(zhì),接種發(fā)酵劑YF-L922、益生菌LC-01的處理組(下同)圖2 冷藏期間不同處理方式的pH值及酸度變化規(guī)律Fig.2 Changes in pH and acidity of different treatments during refrigeration

2.5 濃縮果汁對(duì)發(fā)酵飲料活菌數(shù)的影響

如表4所示,添加不同濃縮果汁的發(fā)酵飲料在0～14 d冷藏期,活菌數(shù)均有所增加,冷藏至14 d后,活菌數(shù)下降。這與目前報(bào)道的發(fā)酵產(chǎn)品冷藏期間中活菌數(shù)的變化規(guī)律類(lèi)似[24,26],冷藏期內(nèi)有機(jī)酸的積累抑制了益生菌增長(zhǎng)。由表4可知,添加藍(lán)莓濃縮汁的產(chǎn)品中活菌數(shù)最低,這是因?yàn)樗{(lán)莓濃縮汁的低pH導(dǎo)致副干酪乳桿菌活性下降[27]。研究發(fā)現(xiàn),添加梨濃縮汁的處理組活菌數(shù)最高(P<0.05),牦牛乳中的乳果糖和半乳糖、濃縮果汁中的菊糖和低聚果糖以及豆乳中的碳水化合物等益生元化合物對(duì)副干酪乳桿菌的生長(zhǎng)具有協(xié)同作用,有助于刺激活菌數(shù)增加[28-29]。與梨、桃濃縮汁相比,添加草莓濃縮汁的處理組副干酪乳桿菌活菌數(shù)較低,可能與草莓中生物活性化合物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌株的抑制作用有關(guān)[30]。

表4 冷藏期間的活菌數(shù)Table 4 Probiotics counts during refrigeration

2.6 濃縮果汁種類(lèi)對(duì)發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

由表5可知,在冷藏的第0和21天,添加梨濃縮汁的處理組風(fēng)味和口感評(píng)分最高(P<0.05);添加草莓濃縮汁的處理組外觀評(píng)分更高更令人滿意,但風(fēng)味和口感的感官評(píng)分較低。根據(jù)產(chǎn)品的感官屬性,添加梨濃縮汁的處理組感官總分最高,可能是因?yàn)槔鏉饪s汁特有的清香味掩蓋了豆乳中的豆腥味;而添加藍(lán)莓濃縮汁的處理組總分最低(P<0.05),可能由于藍(lán)莓濃縮汁酸度太高,影響了發(fā)酵飲料的風(fēng)味和口感[29]。濃縮果汁對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)均有一定影響[29]。綜合發(fā)酵飲料冷藏期間的益生菌活菌數(shù)和感官結(jié)果,添加梨濃縮汁的處理組益生菌活菌數(shù)較高且感官評(píng)分較高,因此選取梨濃縮汁添加至發(fā)酵飲料中。

表5 冷藏期間的感官評(píng)定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results during refrigeration

3 結(jié)論

益生菌的種類(lèi)、牦牛乳與豆乳的比例以及添加濃縮果汁的類(lèi)型對(duì)發(fā)酵飲料感官品質(zhì)及益生菌活菌數(shù)有顯著影響(P<0.05)。以副干酪乳桿菌為益生菌,m(牦牛乳)∶m(豆乳)50∶50的處理組活菌數(shù)最高,感官品質(zhì)最優(yōu)。選取此處理組的發(fā)酵飲料分別添加草莓、梨、桃和藍(lán)莓濃縮汁,添加梨濃縮汁處理并冷藏的處理方式下益生菌活菌數(shù)最高且感官品質(zhì)最優(yōu)(P<0.05)。綜上所述,從益生菌活菌數(shù)、感官屬性等多方面考慮,以副干酪乳桿菌為益生菌、牦牛乳豆乳質(zhì)量比為50∶50的處理方式進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束后添加梨濃縮汁冷藏處理的發(fā)酵飲料可作為一種發(fā)酵飲料。