司波,陸洋,盧永翎,呂麗爽*

1(江蘇省宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,江蘇 宿遷,223800) 2(南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京,210023)

活性羰基化合物(reactive carbonyl species,RCS)是一類活潑小分子,含有一個或多個羰基[1]。常見RCS主要包括乙二醛(glyoxal,GO)、甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)、丙烯醛(acrolein,ACR)、巴豆醛(crotonaldehyde,CRO)、糠醛(furfural,FUR)、4-羥基壬烯醛及5-羥甲基-2-糠醛等。這些RCS被人體攝入后會通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等產(chǎn)生危害,如能通過邁克爾加成反應(yīng)(Michael addition reaction)或席夫堿反應(yīng)(Schiff base reaction)與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的親核位點(diǎn)發(fā)生共價結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞毒性和致突變性。研究表明,RCS體內(nèi)動態(tài)平衡濃度增加源于氧化應(yīng)激,而活性氧體內(nèi)動態(tài)平衡濃度增加也是羰基應(yīng)激的結(jié)果,兩者相互影響,相互增加,形成惡性循環(huán)。而由于RCS相對于活性氧自由基而言更為穩(wěn)定,其對人體危害也更高。常見慢性疾病如糖尿病、阿爾茨海默氏病、尿毒癥[2]等均與RCS相關(guān)。RCS來源之一為日常膳食,包括未加工產(chǎn)品如水果、蔬菜、雞蛋、魚類和肉類,以及在食品加工中通過碳水化合物和氨基酸的熱降解,還原糖和蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)及糖自身的焦糖化反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和微生物代謝發(fā)酵等反應(yīng)形成[3],常見加工食品如奶酪、酒精飲料、甜甜圈、炸薯?xiàng)l等均含有RCS,相關(guān)報道呈逐年遞增之勢。

目前,國內(nèi)外研究已經(jīng)報道了RCS存在于各類酒品中,如白酒、葡萄酒、啤酒、果酒等。在啤酒加工過程中,RCS不僅產(chǎn)生于煮沸和發(fā)酵階段,在啤酒儲存老化過程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)也會產(chǎn)生RCS；而葡萄酒在原料的浸漬、發(fā)酵過程,以及成品的貯藏過程中均有RCS產(chǎn)生,葡萄成熟度越高、浸漬時間越長,葡萄酒中RCS含量越多[4]。啤酒、果酒等酒的加工工藝雖未經(jīng)蒸餾,但其在糖化煮沸和發(fā)酵過程中產(chǎn)生一定量的RCS并存于酒體中。而白酒為蒸餾酒,在蒸餾過程中這些易揮發(fā)的RCS一并帶入酒體。我國的白酒在釀造過程中均涉及到發(fā)酵和高溫餾酒等步驟,除此之外,醬香型白酒和兼香型白酒的高溫制曲,清香型白酒的高溫潤糝,鳳香型白酒的潮火、大火和后火以及豉香型白酒的肉埕陳釀等步驟,均能產(chǎn)生一定量的RCS,如MGO,GO,ACR,FUR等[5]。由于RCS分子量較小,極性強(qiáng),極易與乙醇、水混溶,因而長期存在于酒類產(chǎn)品中。

我國釀酒文化歷史悠久,酒類產(chǎn)品中的RCS與飲食中的RCS含量的疊加,大大增加了由飲食攝入RCS的量,這類物質(zhì)在體內(nèi)的積聚給人體健康帶來威脅。因此酒類產(chǎn)品的質(zhì)量安全狀況與我國人民的生命健康息息相關(guān),這使得對酒類產(chǎn)品中RCS的研究愈發(fā)重要。

1 酒中RCS的種類和來源

1.1 GO

1.1.1 GO的理化性質(zhì)和毒性

GO是一種α-氧代醛,室溫下為液體,熔點(diǎn)約為15 ℃,通常以水合低聚物的形式存在于水溶液中(GO含量為30%～50%),屬于高反應(yīng)活性的糖基化因子,其能夠破壞人體中的核苷酸結(jié)構(gòu),從而抑制細(xì)胞中DNA的合成,引發(fā)DNA的病變[6]。大鼠的GO經(jīng)口半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)為606 mg/kg。此外,GO能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生糖化反應(yīng),引發(fā)蛋白質(zhì)功能的紊亂,一些如阿爾茲海默癥、白內(nèi)障和動脈粥樣硬化等慢性疾病均與GO息息相關(guān)[7],GO也是引起高血糖和糖尿病的原因之一,有研究表明,GO還具有細(xì)胞毒性,其細(xì)胞半致死濃度為(3.6±0.1) mmol/L[8]。

1.1.2 GO在酒類產(chǎn)品中的來源及含量

據(jù)文獻(xiàn)報道,GO存在于多種酒精飲料中,主要源自釀酒酵母的發(fā)酵及釀酒原料在制酒中發(fā)生的美拉德反應(yīng)和油脂氧化等[9]。RODRGUEZ-CCERES等[10]發(fā)現(xiàn)鮮釀啤酒中的GO質(zhì)量濃度為2.8～6.5 mg/L。而經(jīng)過陳釀后啤酒中GO的質(zhì)量濃度上升至(28.6±0.2) mg/L[9]。另外,不同種麥芽(淺色麥芽、深色麥芽、煮沸的麥芽和烘焙的麥芽)釀造啤酒中GO的含量差別非常大,變化范圍為0.464～70.180 mg/kg[11]。不同品種的葡萄酒,GO含量也存在區(qū)別,白葡萄酒、紅葡萄酒及酒精加強(qiáng)型葡萄酒中的GO含量分別為2.15～12.72、4.34～15.54和15.30～28.63 mg/L,酒精加強(qiáng)型葡萄酒中GO含量遠(yuǎn)高于白、紅葡萄酒,同時,隨著貯存時間的增加,3種葡萄酒中的GO含量隨之增加[12]。陳年酒精加強(qiáng)型葡萄酒中GO含量甚至是新鮮酒精加強(qiáng)型葡萄酒的6倍以上[13]。果酒中GO含量可在3.43～60.48 mg/L范圍內(nèi)浮動[14],不同種類果酒中GO含量差異極大,其原因尚有待深入探討。我們前期測定了國內(nèi)不同香型白酒(濃香型、清香型、醬香型等12種香型)中GO的含量,為0.02～0.49 mg/L,與啤酒、葡萄酒和果酒等酒類相比較而言,白酒中GO含量較低。

1.2 MGO

1.2.1 MGO的理化性質(zhì)和毒性

MGO又稱丙酮醛,為2-氧代丙醛,黃色或黃棕色透明液體,有辛辣氣味。2017年10月,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將MGO列在Ⅲ類致癌物的清單中。大鼠MGO的LD50為531 mg/kg。在體內(nèi),MGO能夠引發(fā)線粒體功能紊亂,與蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的反應(yīng),形成非酶糖基化終產(chǎn)物,與糖尿病并發(fā)癥、衰老、尿毒癥等疾病息息相關(guān)[16]。此外,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)表明,由于MGO能夠使一些癌基因和抑癌基因的表達(dá)發(fā)生改變,因此蓄積大量MGO存在致癌風(fēng)險[17]。

1.2.2 MGO在酒類產(chǎn)品中的來源及含量

MGO與GO常常共存于酒類產(chǎn)品中,主要來源于酒中糖酵解、微生物發(fā)酵等步驟[18],常常隨著酒類產(chǎn)品放置時間的延長而增加,在啤酒陳釀過程中MGO含量由544.0 μg/L增加到662.4 μg/L,增加量超20%。CHATTERJEE等[19]使用同種方法測定了購自當(dāng)?shù)厥袌龅钠【啤灼咸丫坪图t葡萄酒中MGO的含量,分別為1.75～3.52、31.46～23.92和9.41～12.38 μmol/L,其中啤酒中MGO的含量遠(yuǎn)低于葡萄酒,而紅葡萄酒和白葡萄酒中MGO含量存在顯著性差異。JEONG等[14]則統(tǒng)計了韓國瑪格麗米酒(64種)、啤酒(31種)、果酒(24種)和韓國清州黃酒(10種)中MGO的含量,瑪格麗米酒、啤酒、果酒和清州黃酒含量分別為：0.42～27.00、1.44～8.41、1.79～78.13和4.18～58.64 μg/g,依然是啤酒含量最低,其中果酒的MGO含量上限最高差異也最大,可能與果酒中高糖含量有關(guān),因?yàn)樘墙徒馐荕GO來源之一。雖然米酒和啤酒中MGO含量低于果酒,但因韓國米酒和啤酒的人均攝入量遠(yuǎn)高于果酒的人均攝入量,因此從米酒或啤酒中攝入的MGO需高度重視,按照MGO最高含量并根據(jù)日攝入量得,韓國每人每天可從米酒和啤酒中攝入33.45和49.14 μg/kg 體重的MGO。此外,我們前期測定了12種不同香型的白酒中的MGO含量為0.03～0.96 mg/L,其中醬香型白酒中MGO含量最高,而豉香型白酒中MGO含量最低。相比較而言,白酒中MGO的含量低于葡萄酒、果酒和啤酒。

1.3 ACR

1.3.1 ACR的理化性質(zhì)和毒性

1.3.2 ACR在酒類產(chǎn)品中的來源及含量

ACR存在于各種酒中,其主要由3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde,3-HPA)脫水生成,而3-HPA主要由甘油(酒精發(fā)酵過程中酵母作用的第三大產(chǎn)物,含量僅次于乙醇和二氧化碳),在克雷伯桿菌屬(Klebsiella),檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和乳桿菌屬(Lactobacillus)等微生物內(nèi),被輔酶B12與甘油脫水酶轉(zhuǎn)化而成,而這種轉(zhuǎn)化在低pH的酒精飲料(如葡萄酒)和涉及高溫加工的酒精飲料(如利口酒)的高溫蒸餾中更易發(fā)生[23]。HERNANDES等[24]針對9種啤酒進(jìn)行研究,檢測到ACR的含量為0.3～2.5 μg/L,ACR含量相對較低。LEDAUPHIN等[25]則測定了自制新鮮蒸餾獲得的蘋果白蘭地酒中ACR的含量,為0.7～5.2 mg/L,隨著酒放置時間的延長,ACR的含量有所下降,而市售蘋果白蘭地酒ACR檢測為0.6 mg/L。FERRIRA等[26]分析了Campanha Gaùcha地區(qū)市售20種葡萄酒,其中50%的葡萄酒中測出ACR,其含量為1～29.8 μg/L,根據(jù)風(fēng)險評估計算,男性每日飲用300 mL該地區(qū)的葡萄酒,其包含的ACR就可能會對健康造成威脅。針對我國白酒,我們實(shí)驗(yàn)室前期測定了12種不同香型的白酒中ACR的含量,約為0.13～0.61 mg/L,不同香型白酒的ACR含量差異相對較小,不同產(chǎn)地的白酒中ACR的含量相比,江蘇省的白酒ACR含量相對較高。

1.4 FUR

1.4.1 FUR的理化性質(zhì)和毒性

FUR又名呋喃甲醛,常溫下為無色透明油狀液體,其包含一個呋喃雜環(huán)和一個醛基官能團(tuán)。早在1978年,FUR就被證明能夠誘導(dǎo)DNA突變[27],同時,其還被證明與小鼠肝臟腫瘤的形成和肺組織損傷密切相關(guān),具有細(xì)胞毒性作用[28],其大鼠口服的LD50為50～127 mg/kg,為高毒物質(zhì)。2017年10月,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將FUR列為Ⅲ類致癌物。

1.4.2 FUR在酒類產(chǎn)品中的來源及含量

FUR是酒類產(chǎn)品中含有的重要醛類之一,主要由戊聚糖在酸性條件下水解成戊糖,再脫水環(huán)化而成,或由酵母發(fā)酵產(chǎn)生。酒精飲料中的FUR還可能是在浸漬和陳釀過程中,木桶熱處理時半纖維素等成分被降解為戊糖進(jìn)而脫水生成[29],FUR含量也受木桶材質(zhì)類型和加熱條件影響,在不同的木桶中釀造紅葡萄酒或白葡萄酒時,FUR含量可在0～135.2 μg/L區(qū)間內(nèi)變化[30]。雖然FUR能夠賦予酒類產(chǎn)品的異香,但濃度過大時不僅會呈現(xiàn)嚴(yán)重的辣味甚至焦苦味還會對人體健康造成威脅。對于啤酒而言,FUR常常被認(rèn)為是啤酒老化的重要標(biāo)志,隨著啤酒老化,FUR常常呈線性增加的趨勢。新鮮啤酒中FUR約為40 mg/L,而陳釀啤酒中FUR含量達(dá)到200 mg/L,是新鮮啤酒的5倍之多[31]。蒸餾酒中含有一定的FUR,如波本威士忌、雞尾酒等,含量為12.4、2.06 mg/L,其他酒精飲料如咖啡酒、櫻桃酒、杏仁酒中也含有一定的FUR,含量分別為24.1、4.44和5.09 mg/L[32]。在中國白酒中,FUR的濃度與白酒香型相關(guān),一般而言,醬香型白酒FUR含量較高而清香型白酒FUR含量較低。許漢英[33]發(fā)現(xiàn)FUR含量與不同香型白酒發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度呈正相關(guān),而醬香型白酒因其發(fā)酵時間長,發(fā)酵溫度高,使得酒中FUR含量較高,這也使得FUR成為醬香型白酒的一個標(biāo)志組分。雖然FUR對白酒的醇香具有一定的貢獻(xiàn),然而,作為對人體明顯有害的醛類化合物,目前尚未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對FUR含量進(jìn)行限定。過高含量的FUR具致癌性、致突變性、細(xì)胞毒性等,研究表明當(dāng)FUR質(zhì)量濃度為30 mg/kg時,有40.3%的大鼠胎鼠的內(nèi)臟畸變,而當(dāng)FUR質(zhì)量濃度達(dá)60 mg/kg時,有6.02%小鼠精子發(fā)生畸變[34]。相關(guān)預(yù)警和含量監(jiān)控需要提上議程。

1.5 CRO

1.5.1 CRO的理化性質(zhì)和毒性

CRO為無色或略帶黃色的液體,可燃,具有催淚性和氧化性。其作為ACR的同源物,具有高毒性,大鼠口服急性毒性的LD50為80 mg/kg,而小鼠口服的急性毒性的LD50為104 mg/kg,且大鼠、小鼠口服后出現(xiàn)胃潰瘍、壞死等癥狀[35]。CRO進(jìn)入體內(nèi)后,能夠刺激呼吸系統(tǒng),引起鼻腔急性炎癥的同時對肺造成損害[36],同時其能降低細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外,CRO還有致突變性、致瘤和致癌性[37]。

1.5.2 CRO在酒類產(chǎn)品中的來源及含量

CRO同樣主要來源于美拉德反應(yīng),目前報道的啤酒中的CRO含量較低,約為0.107 mg/L。在朗姆酒制作過程中,原料甘蔗汁的加熱、預(yù)濃縮、發(fā)酵和老化等多個加工過程中均會形成CRO,含量因制作方式的不同而不同,約為7.19～18.7 mg/L[38]。我們前期檢測發(fā)現(xiàn)在不同香型的白酒中CRO含量也不同,其范圍為0.12～9.52 mg/L,其中豉香型白酒CRO含量最低,而醬香型白酒CRO含量最高,同時,我們還發(fā)現(xiàn)貴州省生產(chǎn)的白酒CRO平均含量最高,為7 mg/L。因此,白酒中CRO含量需引起重視。

2 白酒中RCS檢測方法

2.1 氣相色譜法(GC)

氣相色譜法主要利用試樣中各組分在氣相和固定液體相間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行測定,常用檢測RCS的檢測器主要為：氫離子火焰檢測(flame ionization detector,FID)、電子捕獲檢測器(electron capture detector,ECD)、氮磷檢測器(nitrogen phosphorus detector,NPD)和質(zhì)譜(MS)。RCS類小分子化合物沸點(diǎn)低,易于揮發(fā),為能夠有效分離,常采用衍生化預(yù)處理,常用的氣相色譜法的衍生化試劑包括：1,2-二氨基苯(o-phenylenediamine,DB),N-甲基肼(mono methylhydrazine,MMH),3-甲基苯丙噻唑酮肼(3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone hydrochlorid,MBTH)、2,2,2-三氟乙基肼(2,2,2-trifluoroethyl hydrazine,TFEH),鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽[o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine,PFBHA]、鄰五氟苯基肼(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl hydrazine,PFPH)等。常見酒精產(chǎn)品中RCS的氣相檢測方法見表1。

表1 酒類產(chǎn)品中RCS的氣相檢測方法Table 1 Gas chromatography detection methods of RCS in alcoholic products

在氣相色譜分析RCS中,衍生化試劑PFBHA使用范圍最為廣泛。已有使用PFBHA衍生化分析測定啤酒、波特酒、葡萄酒、中國白酒等酒類產(chǎn)品中RCS的檢測方法,涉及包括GO、MGO、ACR、FUR和CRO在內(nèi)的多種RCS。MS/MS、UV、ECD三種檢測器均適用于PFBHA衍生物的檢測,檢測限(limit of detection,LOD)均較低,最低甚至可達(dá)0.024 μg/L。其次,DB主要作為測定GO、MGO的衍生化試劑,NPD和FID均能用于DB衍生化物的測定,然而,到目前為止,以DB為衍生化試劑測定GO、MGO的LOD較PFBHA高,檢測精度不及PFBHA。其他如OPD也可作為酒類產(chǎn)品中GO、MGO的衍生化試劑,然而其LOD為220和120 μg/L[14],為DB的10倍,檢測準(zhǔn)確度遠(yuǎn)不及DB和PFBHA,更準(zhǔn)確的方法有待開發(fā)。

樣品的衍生化預(yù)處理常受到反應(yīng)條件限制和基質(zhì)干擾,同時使得測定方法繁瑣、耗時、增加成本。已有研究發(fā)現(xiàn),FUR能夠不衍生化直接測定。FID和MS/MS均可作為檢測器,然而LOD為1 140 μg/L,較使用衍生化試劑高約10～100倍。

以上研究均采用氣相色譜法,在分析醛類風(fēng)味物質(zhì)的同時將部分RCS檢出或單一測定某種RCS。目前針對酒中多種RCS同步檢測的專用方法,尚缺乏相關(guān)研究,我們前期報道了采用GC-ECD 同步測定12種醛類,包括5種RCS的方法,操作便捷,方法靈敏度高,不同RCS均能在色譜上基線分離,LOD<2 ng/mL。

2.2 液相色譜法(LC)

高效液相色譜法不通過汽化加熱直接進(jìn)樣,有利于熱敏性物質(zhì)的檢測,同樣用于酒類產(chǎn)品的檢測。液相色譜法測定RCS通常采用二極管陣列檢測器(PDA/DAD)、熒光檢測器(UV)、質(zhì)譜(MS)。由于RCS多為小分子極性化合物,有揮發(fā)性,且有較強(qiáng)的親水性,使得其在色譜柱中常常不保留地流出,同時,其缺少顯色基團(tuán),沒有可離子化的官能團(tuán),難以直接采用色譜法分析,因此樣品通常要進(jìn)行衍生化處理,常用的衍生化試劑主要包括：DB、亞硫酸氫鹽、2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH)、N-丙基-4-肼基-1,8-萘酰亞胺(N-propyl-4-hydrazino-1,8-naphthalimide,NPHNA)、4-(2,3-二甲基-6-喹喔啉基)-1,2-苯二胺[4-(2,3-dimethyl-6-quinoxalinyl)-1,2-benzenediamine,DQB]、3,4-二氨基吡啶(3,4-diaminopyridine,3,4-DAP)等。常見酒精產(chǎn)品中RCS的液相檢測方法見表2。

表2 酒類產(chǎn)品中RCS的液相檢測方法Table 2 Liquid chromatography detection methods of RCS in alcoholic products

在液相色譜分析RCS方法中,DB可以同時作為氣相色譜和液相色譜法測定MGO的衍生化試劑。UV和DAD均可作為DB衍生化物的檢測器,在使用液相色譜測定中,DB-MGO衍生化物的LOD為41 μg/L,LOD較使用氣相檢測高,不及氣相靈敏、穩(wěn)定。除DB外,DNPH也常常用于RCS檢測,其更適用于測定不同種類的RCS如MGO、ACR、FUR和CRO等,檢測限較低,檢測準(zhǔn)確度高。此外,3,4-DAP與GO、MGO的衍生化反應(yīng)也能用作葡萄酒中RCS含量測定的前處理。同氣相檢測相似,FUR同樣可以不通過衍生化預(yù)處理直接使用HPLC分析,已有研究以DAD為液相檢測器,以C18柱為色譜柱,直接進(jìn)樣檢測了蘋果酒、葡萄酒和白酒中的FUR,其LOD 0.013和0.005 μg/L較低,檢測靈敏度甚至高于使用衍生化試劑檢測FUR。

目前采用HPLC方法同時測定多種RCS的方法較少,即使使用衍生化試劑,由于RCS分子量相近,通常使用LC-DAD很難實(shí)現(xiàn)基線分離。有關(guān)液相同步測定多種RCS的方法尚有待進(jìn)一步開發(fā)。

3 結(jié)論

綜上,本文針對白酒、啤酒、葡萄酒、果酒等酒類產(chǎn)品中多種RCS,包括MGO、GO、ACR、FUR、CRO等在加工中可能的來源、不同產(chǎn)品中存在的種類和含量,不同種RCS的危害性,以及常用的檢測方法進(jìn)行了概括和總結(jié)。為進(jìn)一步控制RCS的含量,提高產(chǎn)品安全性,提供了理論基礎(chǔ)。盡管目前針對RCS,尚未出臺相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)和限量規(guī)定,但隨著對RCS的危害、致病機(jī)理等研究的逐步深入,隨著消費(fèi)者食品安全的要求不斷提高,監(jiān)控酒類產(chǎn)品中RCS的含量,提升安全預(yù)警性,對酒類產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,同時對酒類釀造工藝的提升和改進(jìn)也提出了新的研究方向和挑戰(zhàn)。