杜國濤，王青，趙偉偉，張兆波，孫悅，趙鵬程，劉建中

（滄州市人民醫(yī)院 胃腸外科，河北 滄州 061000）

據(jù)最新統(tǒng)計，目前發(fā)達國家和地區(qū)膽結(jié)石患病率達20%；我國膽結(jié)石患病率為10%，膽囊膽固醇結(jié)石患者占比超80%，并呈逐年增加趨勢[1]。隨著我國居民飲食習慣的改變，以膽汁膽固醇過飽和造成的膽囊膽固醇結(jié)石病例為主要亞型，其次為膽囊運動功能異常亞型。膽囊運動障礙、膽固醇代謝紊亂、膽固醇反向轉(zhuǎn)運、代謝紊亂綜合征可導致膽固醇超飽和，引起膽固醇、膽汁酸鹽及磷脂三者比例失衡，進而形成膽結(jié)石[2]。膽囊膽固醇結(jié)石是一種多發(fā)的常見病，結(jié)石的形成過程極其復雜，目前關(guān)于其形成原因?qū)W界尚存爭議，蔣婷等[3]認為膽固醇結(jié)石的形成機制主要包括膽汁中膽固醇超飽和、成核因子致微泡穩(wěn)態(tài)失衡和膽汁纖溶系統(tǒng)紊亂；Swidsinski等[4]認為細菌源性物質(zhì)可通過影響人體免疫代謝產(chǎn)物，進而促使膽囊膽固醇結(jié)石的形成；王強等[5]認為腸道微生態(tài)失衡可影響膽汁酸的肝腸循環(huán)，導致膽汁酸和膽固醇代謝紊亂，在膽固醇結(jié)石的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用；蔣兆彥等[6]認為膽固醇結(jié)石形成的首要條件是膽汁膽固醇過飽和。膽道菌群與人體免疫代謝協(xié)同作用可致使膽囊膽固醇結(jié)石的形成；同時，腸道菌群代謝與人體免疫代謝密切相關(guān)。故本文基于膽囊膽固醇結(jié)石患者膽道菌群、腸道菌群差異性，探討膽、腸菌群交互與膽囊膽固醇結(jié)石形成關(guān)系，為其他結(jié)石類基本的形成原因提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2020年1 月至2020年6 月由滄州市人民醫(yī)院診療的膽囊膽固醇結(jié)石患者42例為研究對象，記入膽固醇結(jié)石組；同時，選取同時期于本院接受膽囊炎、膽囊息肉診治等非膽固醇結(jié)石患者40例為非膽固醇結(jié)石組。兩組患者年齡40～65歲，膽固醇結(jié)石組平均年齡（47.8±10.2）歲，非膽固醇組平均年齡（45.3±4.9）歲。非膽固醇結(jié)石組男、女各20例；膽固醇結(jié)石組中男18例，女24例。兩組患者的性別、年齡、體重、病程等一般資料比較均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究已獲批滄州市人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有的患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

QIAamp DNA Stool Mini Kits化學裂解試劑盒（QIAGEN公司，德國）；MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN公司，德國）；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM試劑盒（上海酶聯(lián)科技生物有限公司，中國）。DYY-61型電泳儀（北京六一儀器廠，中國）；Illumina HiSeq測序平臺（Illumina公司，美國）；MJ PCT220 PCR（MJ公司，美國）。

1.3 樣品收集

非膽固醇結(jié)石組和膽固醇結(jié)石組患者均采用術(shù)中膽囊穿刺法收集膽汁1.5～2.0 mL；膽固醇結(jié)石組在不碎石的情況下，術(shù)中收集直徑為0.8～1.0 cm的結(jié)石，且以無菌生理鹽水沖洗；同時，收集膽固醇結(jié)石患者和非膽固醇結(jié)石患者手術(shù)前一天或當天晨起糞便約10 g；所有樣本于收集后，迅速經(jīng)液氮淬滅后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.4 DNA提取與建庫測序

非膽囊膽固醇結(jié)石患者和膽囊膽固醇結(jié)石患者膽汁、結(jié)石及糞便DNA 提取采用物理破碎及QIAamp DNA Stool Mini Kits化學裂解試劑盒相結(jié)合進行。建庫測序：提取樣品總DNA后，參照相關(guān)文獻設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行16S rRNA基因VI-V2可變區(qū)域的PCR擴增，并采用瓊脂糖凝膠電泳及MinElute Gel Extraction Kit進行對PCR產(chǎn)物進行純化、采用Quant-iTPicGreen dsDNA Kit進行定量分析和均一化形成測序文庫，經(jīng)質(zhì)檢合格的文庫樣本用Illumina HiSeq 2500進行測序，并進行細菌OTU鑒定。

1.5 膽囊膽固醇結(jié)石的定量分析

精密稱重所有結(jié)石樣本，經(jīng)氯仿/甲醇（2:1）萃取后，采用CHOD-PAP法及NanoDrop 2000 分光光度計對結(jié)石樣本定量分析膽固醇含量。

1.6 細菌DNA檢出率及細菌菌落數(shù)比較

利用qPCR方法檢測兩組患者膽汁樣本中DNA陽性率及菌落數(shù)。

1.7 膽汁免疫球蛋白檢測

采用放射免疫檢測試劑盒免疫計數(shù)儀檢測膽汁免疫球蛋白IgA、IgG和IgM表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組細菌DNA檢出率及細菌菌落數(shù)的比較

非膽固醇結(jié)石組患者膽汁細菌DNA 陽性率47.50%（19/40）低于膽固醇結(jié)石組69.04%（29/42）（χ2=3.919，P＜0.05）；同時膽汁細菌菌落數(shù)（3.29±1.21）低于膽固醇結(jié)石組（5.74±1.08）（P＜0.001）。

2.2 兩組膽汁免疫球蛋白檢測比較分析

膽固醇結(jié)石組患者膽汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量顯著高于非膽固醇結(jié)石組，IgG含量略高于非膽固醇結(jié)石組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 膽汁免疫球蛋白檢測比較

2.3 膽囊膽固醇結(jié)石的定量分析

依據(jù)Marschall、Swidsinski和Portincasa學者對膽固醇結(jié)石中膽固醇含量的定義，在所有結(jié)石樣本中，膽固醇含量在≤70%、70%～89%及≥90%分別為3、38及1例。

2.4 兩組菌群分析

測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估：根據(jù)膽汁及糞便樣本各階段的序列長度（AvgLen（bp）），G和C類型的堿基占總堿基的百分比（GC），質(zhì)量值≥20 或30 的堿基占總堿基數(shù)的百分比（Q20 和Q30），有效的優(yōu)化序列的百分比（Effective）等參數(shù)對所有樣本數(shù)據(jù)進行評估，見表2。結(jié)果表明所有測序樣本Q20和Q30大于90%，優(yōu)化序列的百分比均大于80%，符合質(zhì)量評估要求[7]。

表2 樣品測序數(shù)據(jù)處理分析

對優(yōu)化序列在97%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU數(shù)目，可知糞便樣本膽固醇結(jié)石組OTU數(shù)目顯著小于非膽固醇結(jié)石組（P＜0.001）。并分別從界（Kindom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）展示各等級物種數(shù)目統(tǒng)計，可知膽汁樣本膽固醇結(jié)石組種數(shù)目顯著大于非膽固醇結(jié)石組（P＜0.001），見表3。

表3 樣品各等級物種統(tǒng)計表

對樣品Alpha多樣性指數(shù)進行評估，如表4 所示。Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，可得出糞便樣本膽固醇結(jié)石組Chao1和Ace指數(shù)顯著低于非膽固醇結(jié)石組，即膽固醇結(jié)石患者膽汁菌群物種數(shù)量顯著小于非膽固醇結(jié)石組（P＜0.001）。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，據(jù)Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高，可知膽固醇結(jié)石患者糞便菌群物種多樣性小于非膽固醇結(jié)石組。此外，由稀釋性曲線及Shannon指數(shù)曲線均表明膽固醇結(jié)石患者糞便樣本多樣性少于非膽固醇結(jié)石組，見圖1。

圖1 兩組稀釋性曲線（A、B）及Shannon指數(shù)曲線（C、D）

表4 Alpha多樣性指數(shù)分析

鑒于細菌門類型的保守性，其作為最高的分類單元，可異質(zhì)性反映人體特定部位細菌群落結(jié)構(gòu)，故在本實驗中先期對細菌在門水平上進行解析。從中可知，厚壁菌門（Firmicutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）為膽汁中的優(yōu)勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為糞便樣本中的優(yōu)勢細菌類群。其次，人體特定部位微環(huán)境常常由細菌種屬水平來反映，在本實驗中，膽固醇結(jié)石組膽汁及糞便樣本中Roseburia相對豐度均顯著低于非膽固醇結(jié)石組；且非膽固醇結(jié)石組糞便樣本中Sporococcus相對豐度顯著高于膽固醇結(jié)石組。見圖2。

圖2 兩組菌群分析

3 討論

隨著人民生活水平的穩(wěn)步提高，膳食結(jié)構(gòu)以及生活方式發(fā)生了很大變化，如過量攝入高脂肪、高糖類、高膽固醇食物，早餐不規(guī)律，缺乏運動等不健康生活習慣均是形成膽結(jié)石的重要因素。膽結(jié)石又稱膽石癥，是指膽道系統(tǒng)包括膽囊或膽管內(nèi)發(fā)生結(jié)石的疾?。话懩医Y(jié)石、膽總管結(jié)石、肝膽管結(jié)石[8]。膽囊結(jié)石的患者數(shù)量越來越多，我國發(fā)病率高達10%，且集中在＞40歲的人群，主要為膽固醇結(jié)石；其發(fā)生不僅與年齡，飲食，行為習慣相關(guān)，且受肥胖、高脂血癥、2型糖尿病、肝硬化等相關(guān)疾病因素的影響；另外，妊娠作為膽囊結(jié)石常見病因之一，使得女性發(fā)病率遠高于男性[9]。膽固醇結(jié)石的形成與個體中含造石基因的遺傳因素、肝膽固醇的過度分泌、膽汁的過飽和及快速相變、膽囊的運動減弱、腸道菌群等因素有關(guān)[10]。膽囊膽固醇結(jié)石是一種消化系統(tǒng)常見疾病，發(fā)病率逐漸升高，若不及時治療，極有可能引起繼發(fā)感染，導致膽囊癌及膽道系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生，危害患者生命安全。膽囊膽固醇結(jié)石的形成原因較復雜，發(fā)生機制尚未完全闡明。目前已有研究表明，膽色素結(jié)石、混合性結(jié)石、膽固醇結(jié)石中均存在細菌，而細菌可以促進膽固醇過飽和、產(chǎn)生促成核因子、促進免疫球蛋白和黏液蛋白分泌，從而參與結(jié)石的形成[5]。由此推測，膽道細菌感染與膽囊結(jié)石的形成有著密切關(guān)系。

正常生理狀態(tài)下，腸道菌群參與人體內(nèi)物質(zhì)與能量代謝，促進免疫系統(tǒng)發(fā)育與成熟，可形成屏障隔斷病原體對宿主的攻擊，從而維持人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11-12]。然而，一旦腸道微生態(tài)失衡，就可能引起腸炎、結(jié)腸癌和膽囊結(jié)石等慢性疾病的發(fā)生與發(fā)展[5，13]。因此，腸道菌群失衡是膽固醇結(jié)石發(fā)生的關(guān)鍵因素。因此，本文基于膽囊膽固醇結(jié)石患者膽道菌群、腸道菌群差異性，對膽、腸菌群交互與膽囊膽固醇結(jié)石形成關(guān)系進行了探討。結(jié)果顯示，非膽固醇結(jié)石組患者膽汁細菌DNA陽性率47.50%（19/40）低于膽固醇結(jié)石組患者膽汁細菌DNA陽性率69.04%（29/42）（P＜0.05）；細菌菌落數(shù)亦低于膽固醇結(jié)石組（P＜0.05）。膽汁免疫球蛋白檢測結(jié)果表明，膽固醇結(jié)石組患者膽汁中IgA含量顯著高于非膽固醇結(jié)石組（P＜0.05）。菌群分析結(jié)果顯示，厚壁菌門（Firmicutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）為膽汁中的優(yōu)勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteria）及擬桿菌門（Bacteroidetes）為糞便樣本中的優(yōu)勢細菌類群。

目前，有關(guān)膽道菌落結(jié)構(gòu)與膽囊結(jié)石關(guān)系的研究報道較少。一個世紀前有學者在膽結(jié)石患者的膽汁中培養(yǎng)出了多種細菌，推測結(jié)石的形成與膽道細菌感染離不開[14]。研究表明，雖膽囊膽固醇結(jié)石患者與正常人在菌群結(jié)構(gòu)上無明顯差異，但與正常人相比，患者的免疫球蛋白水平明顯升高，這提示結(jié)石的形成可能與免疫球蛋白水平有關(guān)[15-17]。免疫球蛋白IgA、IgG可提升膽固醇成核活性，影響膽囊膽固醇結(jié)石患者的膽道內(nèi)菌群，進而促進膽結(jié)石的形成[15]。方馳華等[18]率先證實膽囊結(jié)石中存在細菌，并認為細菌是形成結(jié)石的重要因素。Lee等[19]研究表明腸源細菌在結(jié)石形成過程中發(fā)揮重要作用；陶應田等[20]認為膽汁中游離膽紅素增多，引起細菌感染，導致結(jié)石形成。本實驗對膽汁免疫球蛋白進行了檢測，發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)石組患者膽汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量顯著高于非膽固醇結(jié)石組，由此可推斷膽囊膽固醇結(jié)石的形成與膽汁免疫球蛋白水平有關(guān)。實驗結(jié)果顯示非膽固醇結(jié)石組患者細菌菌落數(shù)（3.29±1.21）顯著低于膽固醇結(jié)石組患者細菌菌落數(shù)（5.74±1.08）（P＜0.001），推測膽囊膽固醇結(jié)石患者膽道內(nèi)菌群與結(jié)石的形成存在一定的關(guān)系。

腸道微生物參與調(diào)控人體免疫系統(tǒng)、物質(zhì)的能量代謝、涉及氨基酸、維生素等必需營養(yǎng)物質(zhì)的生物合成，在維持機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。腸道菌群隨著外界環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、年齡等因素的改變而波動，但整體維持在一定范圍。代謝性疾病的發(fā)生往往伴隨著腸道微生態(tài)失衡；而膽囊結(jié)石是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，膽汁酸代謝紊亂是其形成的重要因素，且膽汁酸的代謝受腸道菌群的調(diào)節(jié)[21]。因此，從腸道菌群與膽汁酸的關(guān)系的角度探討膽囊結(jié)石的成因，是很有必要的。Wu等[13]以膽囊結(jié)石患者及正常人的膽汁及糞便為研究對象，首次采用16S rRNA擴增子測序技術(shù)對其進行研究，結(jié)果顯示膽囊結(jié)石患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)。劉超等[2]認為膽固醇結(jié)石的發(fā)生與膽汁中膽固醇濃度、促/抑成核因子的動力學穩(wěn)態(tài)有關(guān)。Keren等[22]發(fā)現(xiàn)膽囊切除后，膽汁的流向發(fā)生了改變，引起膽汁酸與腸道微生物之間的關(guān)系發(fā)生改變，進而認為結(jié)石患者治療后復發(fā)率高可能與腸道菌群的改變有關(guān)。鄧太平等[23]研究發(fā)現(xiàn)，膽石癥患者存在胃腸道健康風險，且其體內(nèi)腸道菌群明顯失調(diào)。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)石小鼠腸道中厚壁菌門及其與擬桿菌比值均降低；研究表明無菌小鼠腸道接種細菌后，膽汁酸合成減少，從而促進膽固醇結(jié)石發(fā)生，提示膽汁酸的合成與腸道菌群有關(guān)[25-26]。

通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，膽固醇結(jié)石患者膽汁菌群物種數(shù)量顯著小于非膽固醇結(jié)石組，糞便菌群物種多樣性小于非膽固醇結(jié)石組；厚壁菌門和梭桿菌門為膽汁中的優(yōu)勢細菌類群，厚壁菌門、放線菌門及擬桿菌門為糞便樣本中的優(yōu)勢細菌類群；膽固醇結(jié)石組膽汁及糞便樣本中Roseburia相對豐度均顯著低于非膽固醇結(jié)石組；且非膽固醇結(jié)石組糞便樣本中Sporococcus相對豐度顯著高于膽固醇結(jié)石組。由此可知：膽囊膽固醇結(jié)石患者和非膽固醇結(jié)石患者的膽道、腸道細菌種類相似，相對豐度存在差異，且膽道和腸道中存在共有的細菌，但由于膽囊膽固醇結(jié)石相關(guān)細菌具有復雜性，故膽囊膽固醇結(jié)石的具體發(fā)生機制有待進一步深入研究。