陳家誠，劉路政，陳良，陳騁，許達(dá)峰，林仕勛，羅相相，武金才

（海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院 肝膽胰外科，海南 海口 570311）

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（以下簡稱為肝癌）在我國發(fā)病率和病死率均較高，雖然手術(shù)切除是肝癌治療的主要手段，但大部分肝癌患者確診時腫瘤已處于中晚期，失去手術(shù)機會[1]。近年來，靶向藥物及免疫治療逐漸被應(yīng)用于中晚期或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌患者，為腫瘤降級轉(zhuǎn)化后外科治療創(chuàng)造了機會，也顯著延長了患者的總生存期[1-2]。侖伐替尼（Lenvatinib）作為新一線肝癌靶向治療藥物在中晚期肝癌治療中取得一系列亮眼的成績，但其耐藥問題也逐漸成為患者改善預(yù)后的主要障礙。然而，侖伐替尼耐藥的潛在分子機制尚不清楚。本實驗基于CRISPR/Cas9 sgRNA全基因組文庫結(jié)合Affymetrix表達(dá)譜芯片篩選出侖伐替尼耐藥相關(guān)基因THOC2，并探索其具體分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人SMMC-7721、MHCC-97H及MHCC-LM3肝癌細(xì)胞購于和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司，細(xì)胞均無支原體等污染。侖伐替尼敏感與耐藥肝癌患者癌組織與癌旁組織樣本（各6例）取自海南省人民醫(yī)院肝膽胰外科標(biāo)本庫，并遵從《赫爾辛基宣言》要求，簽署倫理知情同意書。樣本自離體30 min內(nèi)液氮速凍，并在-80℃冰箱內(nèi)保存。穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建中聚凝胺、嘌呤霉素購買于德國Sigma公司，殺稻瘟菌素購于上海翊圣生物科技有限公司。所有細(xì)胞均在含10%的胎牛血清（購于美國GIBCO公司）和1%的雙抗（青霉素和鏈霉素，購于美國Invitrogen公司）條件的杜氏改良培養(yǎng)基（購于美國GIBCO公司）中培養(yǎng)，細(xì)胞傳代胰酶購于美國Invitrogen公司。THOC2、BAX、cyclinD1、c-Myc（一抗）購于上海艾博抗公司，磷酸甘油醛脫氫酶GAPDP（一抗）、二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，IC50 CellTiter-Glo?試劑盒購于美國Promega公司，免疫共沉淀試劑盒購于美國賽默飛公司。侖伐替尼購買于日本衛(wèi)材公司。

1.2 穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建

構(gòu)建對照慢病毒（空載體Empty）和目的病毒THOC2，然后將其感染SMMC-7721細(xì)胞。72 h以后，加入終濃度5 μg/mL的殺稻瘟菌素。每隔2～3 d更換1次含5 μg/mL殺稻瘟菌素的新鮮培養(yǎng)基，配合藥物篩選獲得穩(wěn)定THOC2高表達(dá)的SMMC-7721-THOC2和對照SMMC-7721-Empty肝癌細(xì)胞。

1.3 CRISPR/Cas9 sgRNA全基因組文庫篩選

選擇人SMMC-7721 肝癌細(xì)胞，支原體檢測合格后，行細(xì)胞倍增時間測試、Puromycin篩選預(yù)實驗；IC50 實驗（共3 次）及藥物的最適濃度確定：確定侖伐替尼作用SMMC-7721 細(xì)胞株48 h或72 h的IC50，以不同藥物濃度（μg/mL）處理細(xì)胞14 d，得到藥物濃度為2 μg/mL時細(xì)胞抑制率為36.42%，并選擇以此濃度進行后續(xù)正式實驗。文庫慢病毒擴增包裝：行Cas9 sgRNA文庫擴增，包裝慢病毒；Cas9-sgRNA文庫（GeCKO library，含19 050個靶向基因和1 864個microRNA，且每個靶點設(shè)計6條sgRNA，共計12 萬種慢病毒載體）慢病毒感染：大規(guī)模擴增SMMC-7721細(xì)胞，感染慢病毒，并控制MOI，使大部分細(xì)胞只感染一個病毒，嘌呤霉素藥篩；細(xì)胞加藥培養(yǎng)：加入侖伐替尼（濃度為2 μg/mL）后共培養(yǎng)細(xì)胞，分別在第0天、7天、14天收耐藥細(xì)胞；sgRNA擴增：細(xì)胞基因組DNA純化后使用特異引物擴增sgRNA；高通量測序及數(shù)據(jù)分析：高通量測序定量分析sgRNA在3 個時間點的變化，篩選侖伐替尼敏感相關(guān)的候選基因，包括：測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析；測序數(shù)據(jù)分布等。

1.4 Affymetrix基因表達(dá)譜芯片

將待檢測的12 例侖伐替尼耐藥組及敏感組肝癌組織進行研磨預(yù)處理，使用TRIzol法抽提組織總RNA，并使用天根RNeasy試劑盒進一步的純化。反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，準(zhǔn)備IVT混合液，體外轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)記cRNA，提前在50～60 ℃預(yù)熱aRNA Elution Solution，10 min后進行aRNA純化。準(zhǔn)備aRNA片斷化混合液并進行片斷化反應(yīng)，室溫平衡芯片，同時加適量預(yù)雜交液至芯片，芯片預(yù)熱10 min。雜交液于99 ℃加熱5 min后，45 ℃放置5 min，最大速度離心雜交液5 min。將處理后雜交液加至芯片，45 ℃，60 rpm雜交16 h。最后，進行洗滌、染色和芯片掃描分析。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）

采用兩步法進行RT-PCR。首先，將已抽提好的肝癌組織和細(xì)胞株RNA和稀釋處理后的Oligo（dT）15混勻離心，70 ℃凈置5 min，立即冰水浴，稍離心。根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄說明書配制反應(yīng)體系，混勻后離心，完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將PCR反應(yīng)試劑按照比例配制包含引物（引物信息：THOC2 引物正向序列：5’-ACATTGCCTTGAAACAGGCG-3’，反向序列：5’-A CTGCCCAGAGTAGCCCATA-3’；GAPDH引物正向序列：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反向引物序列：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’），混勻，97 ℃反應(yīng)5 min，立即冰水浴，混勻。經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸及終末延伸共28～36個循環(huán)，4 ℃保存。最終，加（1～10）μL PCR產(chǎn)物和溴芬蘭（1～2.5）μL混勻，加樣，電泳。

1.6 Western blotting分析

提取已建立的SMMC-7721-THOC2 和SMMC-7721-Empty細(xì)胞的總蛋白并檢測濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)模。封閉，孵育一抗與GAPDH（5% BSA-PBST稀釋）4 ℃過夜。洗膜后孵育二抗。采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光，軟件Image J對圖像進行灰度分析。

1.7 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）分析

根據(jù)Co-IP試劑盒說明書，在上述穩(wěn)定構(gòu)建的SMMC-7721-THOC2細(xì)胞基礎(chǔ)上，使用雙琥珀酰亞胺辛二酸酯交聯(lián)抗體和磁珠，用含有蛋白酶抑制劑（Termo，Waltham，MA）的Pierce免疫共沉淀裂解緩沖洗裂解細(xì)胞。在4 ℃與細(xì)胞裂解液孵育過夜后，用細(xì)胞裂解緩沖液洗滌。從磁珠中分離出蛋白并進一步分析。

1.8 病理和免疫組織化學(xué)（immunohistoche-mical staining，IHC）染色分析

將臨床獲得的12例侖伐替尼敏感組與耐藥組肝癌患者癌組織分別制成石蠟切片，烘烤后經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟，蘇木素染10 min，流水沖洗后70%和90%酒精中脫水各10 min，入酒精伊紅染色液染色2～3 min。再次脫水后經(jīng)二甲苯透明后中性樹膠封片。上述對蠟片載玻片進行抗原回收處理。之后，組織切片冷卻和封閉，然后分別用相關(guān)抗體孵育。隨后，將腫瘤標(biāo)本切片與酶標(biāo)二抗混合。最后觀察載玻片。

1.9 生物信息學(xué)分析

采用腫瘤與癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集進行基因的表達(dá)和預(yù)后分析（http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php），GCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.gcbi.com.cn）預(yù)測基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Graphpad Prism 8軟件整理數(shù)據(jù)和繪圖，計量資料兩組比較采用t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲線采用Log-rank檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全基因組CRISPR/Cas9結(jié)合Affymetrix基因表達(dá)譜芯片篩選肝癌與侖伐替尼靶向耐藥相關(guān)基因

我們在Cas9藥篩第7天分析（Day7vsDay0）共發(fā)現(xiàn)339個具有敲除后藥效增敏作用的關(guān)鍵基因，即肝癌細(xì)胞對侖伐替尼不敏感或耐藥的相關(guān)基因；在給藥第14天收集分析（Day14vsDay0）共發(fā)現(xiàn)1 438個上述基因；且其中共53個基因出現(xiàn)在第7和14天的交集（Day7 vs Day14）中，提示這些基因可能具有更重要的研究價值。進一步，我們應(yīng)用Affymetrix表達(dá)譜芯片分析了12 例肝癌組織樣本（其中侖伐替尼敏感組6例，耐藥組6例），結(jié)果提示共有1 233個差異表達(dá)基因（Fold change≥2）（見圖1A），其中THOC2、CTNNB1（β-catenin）、MET（c-Met/HGFR）、HTATIP2、C10orf11、PRDX3、MAST4等7個基因存在于上述（Day7vsDay14）53 個交集基因中（見圖1B、1C），其在侖伐替尼耐藥組中的表達(dá)顯著高于敏感組；且聚類分析發(fā)現(xiàn)該7個基因可以較好地將兩組區(qū)分開來（見圖1D）。

圖1 全基因組CRISPR/Cas9結(jié)合Affymetrix基因表達(dá)譜芯片篩選肝癌與侖伐替尼靶向耐藥相關(guān)基因

2.2 差異基因的生物信息學(xué)分析

我們使用TCGA 數(shù)據(jù)庫中LIHC（Liver Hepatocellular Carcinoma，肝細(xì)胞癌）的數(shù)據(jù)（http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）分析提示，上述7個耐藥基因中3個基因（C10orf11、PRDX3、MAST4）在癌組織與癌旁組織中表達(dá)水平均未見統(tǒng)計學(xué)差異，且除PRDX3外均無生存相關(guān)；其余4 個基因（β-catenin、c-Met、THOC2和HTATIP2）中，THOC2在癌與癌旁中表達(dá)存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異（見圖2A），且與肝癌臨床分期及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（見圖2B、2C）。進一步對我院臨床肝癌及癌旁組織IHC檢測也提示THOC2蛋白在癌組織的表達(dá)（主要在細(xì)胞核）高于癌旁組織（見圖2D、2E、2F、2G）。

圖2 差異基因THOC2在TCGA數(shù)據(jù)庫及THOC2蛋白肝癌組織中的表達(dá)差異

2.3 TCF家族可作為THOC2核轉(zhuǎn)錄的潛在調(diào)控因子

進一步我們預(yù)測調(diào)控THOC2的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)：Wnt通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF蛋白家族可能調(diào)控THOC2進而影響下游Wnt通路（https://www.gcbi.com.cn/gcanalyze/html/generadar/search/singlegene/regregulat/THOC2），預(yù)測提示THOC2與TCF（TCF 1、3、4、11）存在結(jié)合位點（且存在SNP），進而參與調(diào)控Wnt/β-catenin通路（見圖3，表1）。

表1 THOC2可能結(jié)合位點

圖3 THOC2核轉(zhuǎn)錄的潛在調(diào)控因子預(yù)測分析顯示W(wǎng)nt通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF蛋白家族與THOC2密切相關(guān)

2.4 THOC2與Wnt/β-catenin通路在肝癌侖伐替尼耐藥中的關(guān)系

我們構(gòu)建THOC2過表達(dá)質(zhì)粒并成功穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SMMC-7721 細(xì)胞（見圖4A），Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)：與對照組細(xì)胞相比，高表達(dá)THOC2細(xì)胞（SMMC-7721-THOC2）中BAX、cyclinD1、c-myc和β-catenin的表達(dá)水平顯著增高（見圖4B、4C），提示THOC2表達(dá)可能導(dǎo)致Wnt/β-catenin經(jīng)典通路下游靶基因的激活；在此基礎(chǔ)上，免疫共沉淀（Co-IP）初步分析提示THOC2與β-catenin存在密切相關(guān)（見圖4D）。進一步，IHC、RT-PCR和Western blotting檢測上述侖伐替尼敏感及耐藥組肝癌中THOC2和β-catenin的表達(dá)發(fā)現(xiàn)：THOC2和β-catenin在肝癌組織中存在差異化表達(dá)，THOC2在肝癌侖伐替尼耐藥組中的表達(dá)水平高于敏感組（見圖4E、4F、4G）；同時分析顯示THOC2在SMMC-7721、MHCC-97H和MHCC-LM3不同肝癌細(xì)胞中亦存在差異表達(dá)，且在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株中表達(dá)較高（見圖4H）。

圖4 THOC2與Wnt/β-catenin通路在肝癌侖伐替尼耐藥中的關(guān)系分析

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害著我國公民的健康。2018年侖伐替尼獲FDA審核成了治療肝癌的新一線用藥，用于不可切除的肝細(xì)胞癌，改善了肝癌靶向治療缺藥的現(xiàn)狀[3]。我們近期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，部分中晚期肝癌患者在單藥服用侖伐替尼治療后，疾病尚未緩解甚至出現(xiàn)進展，提示侖伐替尼不敏感或耐藥。因此，明確肝癌侖伐替尼耐藥相關(guān)基因，早期檢測評估肝癌患者對侖伐替尼的敏感性并進行前瞻性用藥指導(dǎo)，具有重要的臨床意義。

侖伐替尼是口服多靶點的藥物，抑制參與腫瘤增殖的其他促血管生成和致癌信號通路相關(guān)RTK，主要靶點包括VEGFR1-3、FGFR1-4、PDGFR-a、KIT、RET等[4-5]。本實驗基于CRISPR-Cas9 sgRNA全基因組文庫篩選技術(shù)結(jié)合Affymetrix表達(dá)譜芯片，結(jié)果分析存在THOC2、CTNNB1（β-catenin）、MET（c-Met/HGFR）、HTATIP2、C10orf11、PRDX3、MAST4等7 個侖伐替尼耐藥相關(guān)基因。我們通過TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)3 個基因（C10orf11、PRDX3、MAST4）在肝癌與癌旁中表達(dá)水平均未見統(tǒng)計學(xué)差異、且除PRDX3外均無生存相關(guān)。研究已表明：c-Met、HTATIP2、PRDX3、MAST4均可參與PI3K/ALK/Akt通路，其中c-Met尚可參與Ras-Rac/Rho通路、HTATIP2可介導(dǎo)JAK-STAT3、MAST4可參與PI3K-Akt-mTOR通路[6-9]；而c-Met和HTATIP2已被發(fā)現(xiàn)可分別導(dǎo)致肝癌對侖伐替尼和索拉非尼耐藥[6,10]；β-catenin可介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路，促進肝癌發(fā)生發(fā)展，且與肝癌對索拉非尼耐藥密切相關(guān)[11-12]。β-catenin、c-Met和HTATIP2已在肝癌中已多有報到并與肝癌耐藥相關(guān)，尚未見THCO2在肝癌耐藥中可能的相關(guān)研究報道。

THOC2為THO復(fù)合物（THO complex）的一員，定位于染色體Xq25，含13.2 kb序列，編碼含1593氨基酸的蛋白（分子量為18.3kDa），常表達(dá)于細(xì)胞核中，參與mRNA轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄延伸、核RNA輸出和基因組穩(wěn)定中起著重要的調(diào)控作用[13-14]。在腫瘤相關(guān)研究中，THOC2可促進黑色素瘤侵襲增殖，并且在其在腫瘤組織高表達(dá)與預(yù)后相關(guān)[15]。在耐輻射三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞中，THCO2上調(diào)并通過促進性別決定區(qū)Y-盒轉(zhuǎn)錄因子SOX2 和同源盒轉(zhuǎn)錄因子NANOG轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核釋放，以THOC5依賴的方式促進TNBC細(xì)胞的干性和抗輻射能力。我們通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，THOC2在肝癌較癌旁組織中高表達(dá)，且與患者臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)。細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)上調(diào)THOC2（SMMC-7721細(xì)胞株）可使Wnt/β-catenin經(jīng)典通路下游BAX、cyclinD1和c-myc蛋白水平顯著增高，免疫共沉淀同時表明THOC2與β-catenin存在密切相關(guān)。進一步IHC、RT-PCR和WB提示THOC2 和β-catenin在肝癌組織和中存在差異化表達(dá)，THOC2及β-catenin在侖伐替尼肝癌耐藥組中的表達(dá)高于敏感組，且THOC2在高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC-LM3、MHCC-97H中較SMMC-7721細(xì)胞表達(dá)增高。有相關(guān)研究報道，干擾THOC2 可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并且外泌體THOC2聯(lián)合MYL6B可作為HCC預(yù)后和復(fù)發(fā)風(fēng)險預(yù)測的分子標(biāo)志物，這與我們的研究結(jié)果一致。因此，THOC2可能是導(dǎo)致肝癌侖伐替尼耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因。

綜上，我們基于CRISPR-Cas9 sgRNA全基因組耐藥篩選得到的THOC2基因高表達(dá)可介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路并與侖伐替尼耐藥密切相關(guān)；THOC2基因在侖伐替尼肝癌靶向耐藥中可能具有潛在的重要臨床價值。