馮志寅，吳怡嫻，哈曉丹，陳鄔錦，李秀梅，董娟娟，*

(1．新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤，在癌癥死亡原因中居第4位[1]。食管癌有兩種主要病理類型：食管鱗狀細胞癌和食管腺癌，其中食管鱗狀細胞癌是包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家最常見的組織類型[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，飲酒、吸煙、水果攝入不足、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)偏高是食管癌的主要危險因素[3]。由于民族生活習(xí)慣和遺傳背景的不同，食管癌發(fā)病情況在種族方面有較大差異，我國部分少數(shù)民族食管癌流行病學(xué)統(tǒng)計結(jié)果表明，新疆哈薩克族的食管癌發(fā)病率及病死率最高[4]。因此尋找腫瘤診斷標(biāo)記物并發(fā)現(xiàn)食管癌高發(fā)人群中極具代表意義的哈薩克族食管癌高發(fā)的差異性分子，探討其臨床病理聯(lián)系，對臨床診斷和靶基因治療等具有重要的意義。

血漿游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是一種外周血中游離于細胞之外的DNA。腫瘤來源的cfDNA也稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA中的核酸序列與組織樣本來源的腫瘤特異性核酸序列保持著高度的一致性，且ctDNA的檢測只需抽取外周血，即可從血漿或血清中提取到，對患者不造成創(chuàng)傷，操作方便快捷，并能夠反復(fù)獲取，易于實時監(jiān)控。因此，通過分析ctDNA中一些特定基因的遺傳學(xué)變化，對腫瘤治療進行預(yù)后監(jiān)測具有重要意義。p38MAPK是MAPK途徑的下游絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶家族成員，可調(diào)節(jié)包括細胞增殖、分化，炎癥和應(yīng)激效應(yīng)等多種細胞活動過程。p38MAPK在細胞惡性轉(zhuǎn)化程度高，侵襲能力強時高表達。因此，檢測哈薩克族食管癌患者血液ctDNA中是否含p38MAPK基因，將有助于我們判斷腫瘤惡性程度、治療效果和預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 病例和對照

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2018年12月—2021年1月收治的20例哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前及腫物切除后的清晨空腹外周靜脈血標(biāo)本作為實驗組，10例健康哈薩克族人群的外周靜脈血標(biāo)本作為對照組。實驗組年齡40～71歲，平均年齡61歲；男15例，女5例；腫瘤按國際TNM分期(UICC，2009年)，I期2例，II期7例，III期7例，IV期4例；低分化6例，中分化6例，高分化8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照2010版WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理確診的食管鱗狀細胞癌；②臨床相關(guān)資料完整；③相關(guān)檢查排除多發(fā)性癌；④在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行食管癌根治術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者曾進行過新輔助治療；②局部復(fù)發(fā)患者；③初次確診時即有轉(zhuǎn)移的患者；④術(shù)后病理診斷為非食管鱗狀細胞癌；患者未簽署知情同意書；⑤患者聯(lián)系方式缺失。本次研究所有患者及家屬對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 試劑與儀器血清/血漿游離DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)，抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒、山羊血清溶液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，兔抗人p38MAPK蛋白單克隆抗體(武漢博士德公司，1∶100稀釋)，超微量核酸蛋白測定儀(美國Thermo nanodrop 2000)，梯度PCR儀(美國BIO-RAD T100)。

1.2.2 樣本的采集及處理抽取哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前、腫物切除后的清晨空腹外周靜脈血及健康哈薩克族人群的外周靜脈血10 mL，放入專用的含EDTA抗凝血劑和細胞防腐劑的BCT管中，輕輕倒轉(zhuǎn)8～10次，常溫下保存和運輸，2 h內(nèi)進行離心處理(2 000 g離心10 min，取上清，8 000 g離心10 min)分離血漿，血漿樣本量不低于2 mL。

組織標(biāo)本取哈薩克族食管癌患者腫物切除后的石蠟切片標(biāo)本，儲存于-20℃冰箱待用。

1.2.3 cfDNA的提取參照血清/血漿游離DNA提取試劑盒說明書步驟進行提取，提取的DNA使用超微量核酸蛋白測定儀檢測其濃度和純度，D(260)/D(280)的比值需在1.80～2.00為合格。

1.2.4 PCR法檢測cfDNA中p38MAPK基因按照表1所示配制總體積為25μL的PCR反應(yīng)液，其引物序列由北京華大公司設(shè)計和合成，見表2。反應(yīng)體系先94℃預(yù)變性5 min；然后94℃、1 min，55℃、30 s，72℃、1 min，共30個循環(huán)；最后72℃退火10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL，加2μL上樣緩沖液，于2%瓊脂糖凝膠進行電泳(TBE緩沖液，100 V)，待指示條帶移動到凝膠2/3以上時，停止電泳，于凝膠成像儀觀察分析產(chǎn)物長度。

表1 檢測p38MAPK基因的PCR反應(yīng)體系

表2 檢測p38MAPK基因的PCR引物序列

1.2.5 組織標(biāo)本中p38MAPK蛋白表達免疫組化檢測使用抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒檢測p38MAPK蛋白表達。石蠟包埋組織切成4μm厚度切片，首先在EDTA抗原修復(fù)液中處理，脫蠟脫水后用山羊血清溶液封閉處理。然后采用兔抗人p38MAPK蛋白單克隆抗體進行處理，將載玻片在4℃下避光孵育18 h。充分洗滌后用二抗處理組織切片1 h，洗滌后加DAB顯色液至覆蓋完全。充分顯色后終止并采用蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化評分判定及比較兩位病理醫(yī)師獨立按免疫反應(yīng)評分(immunoreactivity score，IRS)判別染色是否為陽性[5]。以顯色強度×陽性細胞百分比計數(shù)為最終總評分(0～9分)記錄相關(guān)組織切片資料，以大于等于6分為陽性結(jié)果。顯色強度計數(shù)：無染色為0分；細胞核、細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色顆粒高于背景為1分；細胞核、細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)淺棕黃色的顆粒高于背景為2分；細胞核、細胞膜或細胞質(zhì)出現(xiàn)深棕黃色顆粒為3分。陽性細胞百分?jǐn)?shù)計數(shù)：每例免疫組化切片隨機觀察5個視野，隨機計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)≤l%為0分；＞1%～25%(含)為1分；＞25%～50%(含)為2分；＞50%為3分。

收集手術(shù)后的20例哈薩克食管癌患者的臨床病理報告，根據(jù)患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤最大徑、T分期進行分組，分別比較p38MAPK蛋白的陽性表達率在不同組間的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行，計量資料以±s表示并進行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)性分布的資料兩組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗，對個別頻數(shù)過小(≤5)的計數(shù)資料采用Fisher確切概率法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血液樣本的cfDNA含量檢測情況

哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前血液中cfDNA濃度為(0.39±0.20)ng/μL，手術(shù)后血液中cfDNA濃度為(0.32±0.18)ng/μL，健康哈薩克族人群的外周靜脈血中cfDNA濃度為(0.13±0.82)ng/μL。3組人群血液中cfDNA濃度差異顯著(F=7.54，P＜0.05)，其中哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前與腫物切除后的血液中cfDNA濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前、手術(shù)后血液中cfDNA濃度均高于健康哈薩克族人群，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，詳見圖1。

圖1 哈薩克族食管癌患者手術(shù)前后和對照人群血液中的cfDNA水平

2.2 cfDNA中p38MAPK基因檢測結(jié)果

PCR法檢測出20例哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前cfDNA中含p38MAPK基因17例，檢出率85%；手術(shù)后cfDNA中含p38MAPK基因15例，檢出率75%；10例健康哈薩克族人群的cfDNA中含p38MAPK基因3例，檢出率30%。3組人群cfDNA中p38MAPK基因檢出率有顯著差異(χ2=9.00，P＜0.05)，其中手術(shù)治療前人群cfDNA中p38MAPK基因檢出率顯著高于健康人群組(P＜0.05)，手術(shù)后cfDNA中p38MAPK基因檢出率與健康人群組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，手術(shù)切除腫物前、后cfDNA中p38MAPK基因檢出率差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，詳見表3。

表3 cfDNA中p38MAPK基因檢測情況

2.3 手術(shù)后組織標(biāo)本中p38MAPK蛋白免疫組化檢測結(jié)果

對20例哈薩克族食管癌患者術(shù)后石蠟包埋組織進行臨床病理指標(biāo)分析，免疫組化提示p38MAPK蛋白在高、中分化組的陽性表達率高于低分化組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.939，P＜0.05)。在腫瘤最大徑≤2.5 cm組中的陽性表達率高于＞2.5 cm組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.014，P＜0.05)。p38MAPK蛋白的陽性表達率在年齡、性別、T分期之間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2和表4。

表4 哈薩克族食管癌患者組織中按臨床病理指標(biāo)分組的p38MAPK蛋白表達水平分析

圖2 哈薩克族食管癌患者p38MAPK蛋白表達的免疫組化評分示例圖

3 討論

食管癌早期不易診斷，患者出現(xiàn)吞咽困難或胸骨后疼痛等癥狀時常已處于晚期，病死率高。我國食管癌的發(fā)病率具有明顯的地域性和民族特異性，其中哈薩克族發(fā)病率為全國各民族發(fā)病率最高，并且具有顯著的家族聚集現(xiàn)象[6]。因此尋找腫瘤診斷標(biāo)記物并發(fā)現(xiàn)哈薩克族食管癌高發(fā)的差異性分子，探討其臨床病理聯(lián)系，對臨床診斷和靶基因治療等具有重要的意義。ctDNA來源于機體所有荷瘤部位，包括腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶，甚至微小殘留病灶[7]。腫瘤細胞在凋亡和壞死的過程中可釋放DNA進入循環(huán)中，即ctDNA，是cfDNA的一部分。cfDNA的檢測屬于液態(tài)活檢范疇，具有創(chuàng)傷小、安全、可避免腫瘤內(nèi)取樣異質(zhì)性等優(yōu)點[8]。另外，通過治療過程中的連續(xù)采樣，cfDNA可早于影像學(xué)檢查預(yù)測和動態(tài)監(jiān)測治療效果[9]。本次研究發(fā)現(xiàn)食管癌高發(fā)人群中哈薩克族食管癌患者手術(shù)治療前、手術(shù)后血液中cfDNA濃度均高于健康哈薩克族人群，提示血液cfDNA含量的測定可用于早期腫瘤篩查。

p38MAPK作為MAPK途徑的下游絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶家族成員在細胞的惡性轉(zhuǎn)化中涉及了：生長信號的自我維持、無限的復(fù)制潛能、抗細胞凋亡、血管生成、以及組織浸潤和轉(zhuǎn)移，在哺乳動物的各組織細胞中廣泛的低表達[10]。Gao等[11]通過對肝癌細胞系HepG2研究發(fā)現(xiàn)，血管生長因子可通過p38MAPK相關(guān)通路增加該細胞系的異質(zhì)性黏附作用，從而增強腫瘤細胞的侵襲力。陳紅芳等[12]通過對乳腺癌細胞系MDA-MB-231研究發(fā)現(xiàn)，JAK酶抑制可以通過阻斷p38MAPK而抑制該細胞系的侵襲力，也間接表明p38MAPK與腫瘤細胞侵襲存在相關(guān)性。結(jié)合以上，p38MAPK在細胞惡性轉(zhuǎn)化程度高，侵襲能力強時高表達。本研究通過對哈薩克族食管癌患者組織標(biāo)本中p38MAPK免疫組化檢測情況可知高、中分化組p38MAPK蛋白的陽性表達率高于低分化組，腫瘤最大徑≤2.5 cm組高于＞2.5 cm組。該結(jié)果不僅說明p38MAPK在食管鱗狀上皮細胞發(fā)生惡變時表達顯著提高，而且提示了p38MAPK的表達可能在低分化食管癌中有所缺失，抑或隨著分化程度的降低，腫瘤細胞從信號通路的多樣性中受益來調(diào)控多重的細胞過程[13]。20例食管癌高發(fā)人群哈薩克族患者手術(shù)治療前cfDNA中p38MAPK基因表達檢出率顯著高于健康人群組(P＜0.05)，結(jié)合cfDNA中特異性基因表達變化與腫瘤負荷變化趨勢一致，動態(tài)監(jiān)測cfDNA中特定基因的存在可幫助篩查腫瘤發(fā)生和腫瘤治療后隱匿性轉(zhuǎn)移，因而說明監(jiān)測食管癌患者血液cfDNA中p38MAPK基因可為臨床治療判斷腫瘤惡性程度、預(yù)后情況提供一定的判定依據(jù)。但在低分化食管癌中p38MAPK的作用機制尚需進一步研究。

綜上所述，食管癌高發(fā)人群中哈薩克族食管癌患者血液中cfDNA濃度顯著高于健康哈薩克族人群，可作為食管癌診斷和化療療效預(yù)測的一個潛在指標(biāo)，具有重要的臨床應(yīng)用潛力。但由于本研究樣本偏小，研究結(jié)果需要進一步擴大樣本驗證。哈薩克族食管癌患者血液cfDNA中p38MAPK基因表達檢出率顯著高于健康人群組，說明檢測食管癌患者血液中cfDNA中是否含p38MAPK基因，將有助于我們判斷腫瘤惡性程度、治療效果和預(yù)后，進而為揭示cfDNA中p38MAPK基因能否作為檢測食管癌病情的新型分子標(biāo)志物作一初步探討。

目前關(guān)于食管癌中cfDNA的研究還比較少，但國內(nèi)外現(xiàn)有的各種分析結(jié)果表明cfDNA檢測在食管癌早期診斷、監(jiān)測和預(yù)后是非常有潛力的非侵入性檢測技術(shù)[14]。在未來的研究中可通過擴大樣本量、結(jié)合患者治療不同階段及生存分析驗證研究結(jié)果，深入探討cfDNA中p38MAPK基因及其變異檢測在食管癌篩查、治療過程中與腫瘤負荷之間的關(guān)系。