辛雨濛，梁桓熙，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488)

據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌發(fā)病率高于肺癌，成為全球第一大癌癥[1-2]。乳腺癌多發(fā)生于乳腺導(dǎo)管上皮或腺小葉，是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子的作用下，發(fā)生增殖失控造成的[3-5]?，F(xiàn)階段治療乳腺癌主要以手術(shù)治療為主，配合以放療、化療、內(nèi)分泌治療等，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，放化療易造成不良反應(yīng)，利用中醫(yī)中藥治療既是一種輔助治療手段，又可明顯改善患者體質(zhì)，減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能，降低化療放療的毒副作用，有效延長患者的生存期[6-8]。

甘草干姜湯(licorice and dried ginger decoction，LDGD)來自張仲景《傷寒雜病論》和《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣脈證治》。甘草甘溫而補中益氣，干姜辛溫而溫復(fù)脾肺之陽，全方躁烈性不強、藥性平和、具有補中復(fù)陽之功。乳腺癌在中醫(yī)常歸為“乳癌”“石榴翻花發(fā)”“乳巖”“乳石”“乳毒”“奶巖”等。現(xiàn)代中醫(yī)治療乳腺癌多為補虛益腎，疏肝健脾，行氣養(yǎng)血，與肝經(jīng)、脾經(jīng)、腎經(jīng)的關(guān)系最為密切[9]。因此甘草干姜湯可能用于乳腺癌的治療。本實驗以荷小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的小鼠模型為研究對象考察甘草干姜湯的抗乳腺癌作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

1.1.1 LDGD的制備甘草、干姜等飲片購自安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司(甘草批號1801001，干姜批號1806001)。稱取甘草飲片30 g，干姜飲片15 g，加入450 mL純水，將中藥藥材投入圓底燒瓶，使用加熱回流的方式進行提取，從微沸時開始計時，2 h后轉(zhuǎn)移藥液，再加入360 mL純水進行提取，從再次微沸時開始計時，1.5 h后與之前藥液合并，離心除渣后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮后的藥液置于-80℃預(yù)凍，過夜后使用凍干機，凍干48 h，得到中藥凍干粉。根據(jù)最后所得凍干粉的質(zhì)量和生藥量來計算凍干粉得率。

根據(jù)生藥量計算所需凍干粉的質(zhì)量，精密稱取LDGD凍干粉，溶于相應(yīng)體積的純水中，室溫震蕩溶解后，密封于4℃冰箱保存。

1.1.2 實驗試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。DMSO、NCTD均購自Sigma公司；青霉素、鏈霉素溶液均購自Amresco公司；胰蛋白酶購自北京拜爾迪生物科技有限公司。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自Ameresco公司，氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 RPMI-1640完全培養(yǎng)基按照RPMI-1640培養(yǎng)基粉劑說明書進行配制，每1 L培養(yǎng)基中加入2.0 g NaHCO3，使用1 mol/L的NaOH/HCL調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，用0.22μm濾膜過濾除菌，使用前加入青霉素、鏈霉素和胎牛血清，4℃保存。

1.1.4 PBS緩沖液稱取0.2 g KCl、8 g NaCl、3.48 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KH2PO4，加1 L雙蒸水，攪拌溶解，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，121℃、30 min滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.5 胰蛋白酶量取100 mL PBS緩沖液，稱取0.25 g胰蛋白酶粉末溶解于PBS中，滴加2%酚紅兩滴，以1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，加入0.02 g EDTA-Na2，0.22μm微孔濾器過濾除菌，得到含0.02%EDTA、0.25%的胰蛋白酶，4℃保存。

1.2 細(xì)胞系及動物

小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，來自本課題組，-80℃凍存；BALB/c雌性小鼠，購自北京斯貝福公司，合格證號SCXK(京)2019-0010。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機和微量移液器，購于Eppendorf公司；電子天平，購于Mettler Toledo公司；高壓蒸汽滅菌鍋(AUTOCLAVE)，購于Sanyo公司；超低溫冰箱，購于美國Sanyo公司；倒置顯微鏡(TE2000-S)，購于Nikon公司；；低速軌道式搖床(SK-L330-Pro)，購于大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基放置至室溫，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度穩(wěn)定至37℃。將細(xì)胞自-80℃超低溫冰箱中取出，置于37℃水浴鍋中輕晃融化。在超凈臺內(nèi)取無菌15 mL離心管，加入4 mL培養(yǎng)基，吸取融化的細(xì)胞懸液沿離心管壁緩慢加入，輕輕吹打混勻，1 000 r/min離心2 min。離心后棄去上清，加入1 mL培養(yǎng)基輕輕將細(xì)胞吹打均勻，取一個新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入5 mL新培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2 4T1荷瘤小鼠模型的建立對小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1進行體外細(xì)胞擴大培養(yǎng)，滿足實驗需求細(xì)胞數(shù)量，使用前進行消化、計數(shù)后重懸于PBS中，使用接種針將細(xì)胞懸液注射于小鼠右前肢腋下，每只小鼠接種1×106個細(xì)胞，每只0.2 mL。正常對照組在小鼠右前肢腋下注射等量的PBS。

1.4.3 給藥方案38只雌性BALB/c小鼠共分5組：正常對照組6只，模型對照組和LDGD低、中、高劑量組每組8只。從接瘤后次日起，LDGD低、中、高劑量組小鼠分別按0.1、0.3、0.9 g/kg灌胃給藥，每日1次，根據(jù)小鼠體質(zhì)量對灌胃體積進行微調(diào)，使每只小鼠的灌胃體積均在0.2 mL左右。正常對照組、模型對照組灌胃蒸餾水，連續(xù)20 d。

1.4.4 指標(biāo)檢測實驗過程中每天記錄小鼠體質(zhì)量的變化，從第10天開始使用游標(biāo)卡尺對腫瘤組織的最長徑(a/mm)和最短徑(b/mm)進行測量，用于計算腫瘤體積：瘤體積=1/2×a×b2。共給藥20 d，第20天給藥后禁食12 h，次日最后一次給藥后稱體質(zhì)量，摘取眼球取血，4℃、3 000 r/min離心15 min收集血清，用于檢測肝腎生化指標(biāo)：白蛋白(ALB)、血清堿性磷酸酶(ALP)、丙谷轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌 酐(CRE)、直 接 膽 紅 素(DBIL)、尿 酸(UA)。剝離腫瘤并解剖取其肝臟、腎臟、胸腺、脾臟組織，稱質(zhì)量記錄。

1.4.5 腫瘤組織病理切片HE染色腫瘤組織4%多聚甲醛進行固定。將固定好的腫瘤組織進行石蠟包埋、切片、HE染色。染色后的腫瘤組織切片顯微鏡下觀察。HE染色后，蘇木素可將細(xì)胞核染成藍(lán)色，伊紅可將細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24和Graphpad Prism 7軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，使用單因素方差分析對多樣本均數(shù)進行比較，使用t檢驗對兩樣本均數(shù)進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

各組荷瘤小鼠剝離的腫瘤見圖1，可以看出，甘草干姜湯高劑量組小鼠的腫瘤體積顯著小于模型組。記錄給藥后第2～20天荷瘤小鼠體質(zhì)量的變化(表1)，甘草干姜湯各劑量組與模型對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從第10天開始測量并記錄腫瘤體積變化，如表2所示，模型對照組腫瘤生長速度較快，體積較大，而甘草干姜湯給藥組的腫瘤體積隨著劑量的增加逐漸減小，生長速度變緩。

表2 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

圖1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

表1 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠體質(zhì)量的影響

剝離腫瘤后對腫瘤質(zhì)量進行分析(表3)，結(jié)果顯示與模型對照組相比，甘草干姜湯高劑量組顯著抑制了小鼠腫瘤的生長，抑瘤率為(44.76±0.06)%(P＜0.01)，中劑量組抑瘤率為(15.68±0.21)%(P＜0.05)，而模型對照組、甘草干姜湯低劑量的腫瘤質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量的影響

2.2 甘草干姜湯作用后4T1荷瘤小鼠病理組織切片分析

荷瘤小鼠腫瘤組織切片HE染色后觀察(圖2)，可見與模型對照組相比，甘草干姜湯高劑量組的腫瘤壞死區(qū)域面積顯著增多，壞死區(qū)域腫瘤細(xì)胞存在細(xì)胞核固縮現(xiàn)象。

圖2 腫瘤組織切片HE染色分析

2.3 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠免疫功能的影響

與正常對照組相比，模型組和LDGD各劑量組的脾臟系數(shù)均顯著增加，但LDGD低、中劑量組的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)與模型對照組比均無明顯變化；LDGD各劑量組的脾臟系數(shù)隨濃度增加逐漸減小，LDGD高劑量組的脾臟系數(shù)與模型對照組相比顯著降低(表4)。

表4 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠免疫器官的影響

2.4 甘草干姜湯對4T1荷瘤小鼠肝臟、腎臟功能的影響

與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的肝臟系數(shù)均顯著增加；但LDGD各劑量組的肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)與模型對照組比無明顯變化(表5)。與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN水平升高，而與模型對照組相比，LDGD各劑量組的各指標(biāo)均無顯著性差異(表6)，LDGD對小鼠肝腎功能指標(biāo)均無明顯影響。

表5 甘草干姜湯對荷乳腺癌4T1小鼠肝腎系數(shù)的影響

表6 甘草干姜湯對荷小鼠乳腺癌4T1小鼠肝腎血生化指標(biāo)的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，LDGD可以抑制4T1荷瘤小鼠的腫瘤生長。給藥20 d后，GDLD高劑量組荷瘤小鼠的腫瘤體積比模型組顯著減小，對腫瘤質(zhì)量的抑制率可達(dá)(44.76±0.07)%；GDLD各劑量組小鼠體質(zhì)量與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，腫瘤組織病理切片分析表明GDLD高劑量組的腫瘤壞死區(qū)域面積顯著增多；LDGD低、中劑量組的脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)與模型對照組相比沒有明顯變化，說明藥物自身對小鼠的胸腺和脾臟影響不大，而LDGD各劑量組的脾臟系數(shù)隨濃度增加逐漸減小，LDGD高劑量組的脾臟系數(shù)與模型對照組有顯著差異，說明LDGD有助于小鼠脾臟功能的恢復(fù)；與模型對照組相比，LDGD各劑量組的肝腎系數(shù)無顯著性差異；與正常對照組相比，模型對照組和LDGD各劑量組的ALP、ALT、CRE水平降低，BUN、O/P水平升高，而與模型對照組相比，LDGD各劑量組的各指標(biāo)均無顯著性差異，說明模型對照組和LDGD各劑量組小鼠的肝腎血生化指標(biāo)變化由荷瘤引起，LDGD對小鼠肝腎指標(biāo)無明顯影響，說明LDGD無明顯肝腎毒性。上述實驗結(jié)果表明，LDGD在實驗劑量范圍有一定抗腫瘤作用，無明顯的肝腎毒性和免疫抑制作用。

目前利用甘草干姜湯研究抗腫瘤作用的實驗研究較少，但有報道其作用于其他功能的研究進展。例如甘草干姜湯以0.96 g/kg的劑量，給藥28 d可以調(diào)整大鼠體內(nèi)Th1/Th2的比例，進而調(diào)節(jié)白介素IL-2、IL-5、IL-4、干擾素IFN-γ的表達(dá)，增強免疫功能，改善變應(yīng)性鼻炎的癥狀[10-12]；甘草干姜湯以2 g/kg的劑量，給藥28 d作用于大鼠還能提高肺組織超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的水平，降低脂質(zhì)過氧化物的水平，清除體內(nèi)過多的自由基，增強抗氧化防御系統(tǒng)，同時調(diào)控TGF-β和SIRT1的表達(dá)，抑制肺纖維化[13-15]。

本研究初步探討了甘草干姜湯體內(nèi)抗乳腺癌作用及對主要免疫器官胸腺及脾臟、主要藥物代謝器官肝臟和腎臟的作用，明確了甘草干姜湯具有一定的抗乳腺癌作用，并且無明顯的肝腎和免疫毒性。本研究為甘草干姜湯臨床用于乳腺癌治療提供了一定數(shù)據(jù)支持，也有助于基于甘草干姜湯的抗腫瘤中藥新藥研發(fā)，下一步需結(jié)合生物信息學(xué)、藥物化學(xué)和分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)進一步揭示甘草干姜湯抗腫瘤的作用機制。