梁 峰，張 瑋，李 飛，王勝杰，杜宇晶，張迎春

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是中國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升和年輕化趨勢[1]。盡管結直腸癌的診斷與治療已經取得了顯著進步，但其療效及預后仍不容樂觀[2]。因此，結直腸癌的早期診療依然是本領域的研究重點。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指長度大于200 nt的非編碼RNA，廣泛參與調控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等多種生物學過程[3-4]。lncRNA在細胞周期、表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等生物學過程中發(fā)揮著重要作用，尤其是參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[5-7]。癌癥易感性候選基因9(cancer susceptibility candidate 9，CASC9)是具有致癌作用的lncRNA，在肝癌、非小細胞肺癌等多種惡性腫瘤中高表達[8-9]。本課題組前期研究發(fā)現CASC9在結直腸癌細胞中表達升高，CASC9可作為miR-195-5p吸附海綿靶向調控細胞周期蛋白D1表達，從而促進結直腸癌細胞的增殖并抑制其凋亡[10]。然而，目前關于lncRNA CASC9在結直腸癌中的臨床意義報道較少。因此，本研究擬收集結直腸癌患者癌組織和癌旁組織，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)法檢測lncRNA CASC9的表達情況，探討lncRNA CASC9在結直腸癌中的表達及其臨床意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年7月—2017年1月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院接受手術切除后液氮保存的87例新鮮冰凍結直腸癌組織及配對癌旁組織，同時獲取臨床資料。所有患者通過電話或門診隨訪3年，隨訪截至2020年1月30日。87例結直腸癌患者中，男48例，女39例；年齡35～75歲，平均(57.46±12.63)歲；根據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM分期，其中Ⅰ期18例，Ⅱ期45例，Ⅲ期24例；根據世界衛(wèi)生組織(WHO)病理分化標準，低分化33例，中分化41例，高分化13例。最終納入研究的患者均經病理切片證實為結腸癌或直腸癌。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入標準和排除標準

納入標準為：①患者臨床資料完整；②術前從未接受過介入、射頻消融術、放化療及免疫治療；③經病理切片證實為結腸癌或直腸癌。排除標準為：①合并其他類型腫瘤；②術前曾接受過放、化療或中醫(yī)治療；③腫瘤以外其他原因導致的患者死亡。

1.3 實時熒光定量PCR檢測lnc RNA CASC9在結直腸癌及癌旁組織中的表達

使用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA，超微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。每組樣本取1 μg RNA，根據逆轉錄試劑盒[RNA PCR Kit(AMV)，TaKaRa]說明書，將RNA逆轉錄為cDNA，-20℃保存。以1μL cDNA為模板，按照qPCR試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit，TaKaRa)說明書，進行qPCR擴增。反應體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，PCR上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 7.8μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，68℃延伸45 s，共40個循環(huán)。產物經瓊脂電泳，以Labworks 4.5圖像分析系統進行分析，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。引物序列如下：CASC9上游5′-TTGGTCAGCCACATTC ATGGT-3′，下 游5′-AGTGCCAATGACTCTCCAGC-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和百分率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制不同lncRNA CASC9表達水平患者組間的生存曲線，并應用Log-rank檢驗比較兩組間生存率的差異，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 lnc RNA CASC9在結直腸癌及癌旁組織中的表達情況

qPCR檢測結果顯示，lncRNA CASC9在結直腸癌組織中的表達(6.395±0.164)較癌旁組織(2.387±0.098)明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.01)。見圖1。

圖1 lncRNA CASC9在結直腸癌組織和癌旁組織中的表達

2.2 lncRNA CASC9與結直腸癌組織病理指標的關系

以lncRNA CASC9在87例結直腸癌組織中相對表達量的中位值(6.61)為界，將患者分為高lncRNA CASC9表達組(n=52)和低lncRNA CASC9表達組(n=35)，并分析其表達水平與結直腸癌患者臨床病理指標的相關性。相關性分析結果顯示，結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達水平與癌組織的不同分化程度(χ2=6.877，P=0.032)、TNM分期(χ2=7.660，P=0.022)、是否發(fā)生淋巴結轉移(χ2=9.901，P=0.002)明顯相關，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤位置無明顯相關關系(均為P＞0.05，表1)。

表1 結直腸癌組織中l(wèi)nc RNA CASC9的表達水平與病理指標的關系(n=87)

2.3 lncRNA CASC9在結直腸癌組織中的表達與患者術后生存率的關系

術后隨訪3年，根據隨訪資料，繪制lncRNA CASC9低表達組和高表達組的生存曲線并進行Logrank檢驗分析。結果顯示，lncRNA CASC9高表達組患者的總生存期(overall survival，OS)和無進展生存期(progression-free survival，PFS)均明顯短于低表達組(χ2=17.91，P＜0.01；χ2=11.23，P=0.001)。見圖2。

圖2 lnc RNA CASC9表達與結直腸癌患者術后生存曲線的關系

3 討論

越來越多的證據表明，lncRNA表達失調與腫瘤的發(fā)生、進展和預后不良有關，可作為腫瘤早期診斷的新型生物標志物[11]。值得注意的是，有研究發(fā)現lncRNA CASC9的表達與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關[12-14]。Yang等[15]研究表明lncRNA CASC9在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中顯著高表達，且與患者腫瘤大小、臨床分期、區(qū)域淋巴結轉移和總生存期相關。Wu等[16]發(fā)現，食管鱗狀細胞癌組織芯片顯示lncRNA CASC9在該研究中l(wèi)ncRNA表達上調最多，且高表達lncRNA CASC9的患者預后較差；體內外研究表明lncRNA CASC9表達下調可顯著抑制食管鱗狀細胞癌細胞體外生長和裸鼠腫瘤發(fā)生。Zhan等[17]研究發(fā)現lncRNA CASC9在膀胱癌中的表達明顯上調，并與組織學分級、TNM分期和預后有關。進一步研究發(fā)現lncRNA CASC9充當miR-497-5p分子海綿，上調卷曲同源物6(FZD6)表達，隨后激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進膀胱癌的發(fā)生與發(fā)展。Zhao等[18]研究表明lncRNA CASC9在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達上調，并且lncRNA CASC9的表達水平也被證實是非小細胞肺癌獨立的預后因素。上述研究表明，lncRNA CASC9影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

然而，關于lncRNA CASC9評價結直腸癌臨床預后價值的相關研究卻鮮有報道。因此，本研究著重探討lncRNA CASC9的表達與結直腸癌患者臨床病理指標以及預后之間的關系。本研究應用qPCR技術檢測87例結直腸癌和相應癌旁組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達水平，結果顯示lncRNA CASC9在結直腸癌組織較癌旁組織中呈明顯高表達，且其表達水平高低與結直腸癌發(fā)展的多個臨床因素密切相關。本研究進一步分析了不同病理指標結直腸癌組織中l(wèi)ncRNA CASC9的表達情況，結果發(fā)現分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴結轉移者lncRNA CASC9陽性表達率越高，其中分化程度、TNM分期是腫瘤惡性生物學行為的表現，而淋巴結轉移是結直腸癌患者預后不良的重要指標，提示lncRNA CASC9的異常高表達可能預示著結直腸癌患者預后不良。接下來，我們分析了lncRNA CASC9表達水平與結直腸癌患者預后的關系，結果顯示，lncRNA CASC9高表達組患者的術后總生存期和無病生存期明顯短于lncRNA CASC9低表達組。

綜上所述，lncRNA CASC9在結直腸癌組織中的表達明顯升高，與結直腸癌的分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關，其有可能成為判斷結直腸癌患者預后的潛在生物標志物。本研究在今后也將擴大樣本收集量，以進一步確認lncRNA CASC9表達與結直腸癌患者臨床病理特征的關系，并對相關機制進行深入研究。