王 晗，周 滔，徐云東，郭錫漢，倪 娟，汪 旭，*

(1．云南師范大學生命科學學院，云南 昆明650500；2．云南師范大學生物能源持續(xù)開發(fā)與利用教育部工程研究中心，云南 昆明 650500)

納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，TiO2-NPs)在日常生活中應用廣泛，其對人體的遺傳毒性效應已成為公共衛(wèi)生領域關注的熱點[1]。已有研究表明，TiO2-NPs可在人體多器官尤其是肝臟和肺臟中大量累積[2]。離體情況下，TiO2-NPs可以通過誘導細胞產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)、消耗細胞中谷胱甘肽，引起細胞炎癥導致細胞死亡[3-5]。部分動物實驗表明，攝入過量的TiO2-NPs可激活肝、肺細胞中多種應激通路，引起細胞死亡，進而損傷肝、肺等器官[6-7]。

端粒(telomere)是穩(wěn)固真核細胞染色體末端特殊且重要的結構，端粒長度(telomere length，TL)改變會影響染色體末端穩(wěn)定和細胞增殖，誘發(fā)染色體不穩(wěn)定(chromosome instability，CIN)，引起端粒功能紊亂，誘導細胞死亡甚至癌變[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs可誘導人正常肝L-02細胞大量ROS產(chǎn)生、TL縮短、CIN升高[9]。TiO2-NPs的遺傳毒性可通過誘發(fā)TL改變，進而導致端粒功能障礙所致。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)表現(xiàn)出了較好的納米顆粒遺傳毒性抑制效應[10]。那么，TiO2-NPs誘導的正常細胞TL改變等遺傳損傷效應，是否可以被抗氧化劑NAC抑制，成為本研究探究的重點。因此，本文擬在人肝細胞L-02及肺細胞HBE中，采用TiO2-NPs單獨暴露及其與NAC聯(lián)合暴露，檢測兩種細胞TL、CIN及細胞死亡率的改變情況，為研究NAC在抑制TiO2-NPs誘發(fā)遺傳毒性中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株培養(yǎng)及分組處理

人正常肝細胞L-02(中國科學院上海細胞庫)和人正常肺上皮細胞HBE(中國科學院昆明細胞庫)分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。實驗用TiO2-NPs(Sigma，德國)及NAC(索萊寶，北京)均用超純水配制。為確保TiO2-NPs分散液均勻，每次使用前均需要將分散液置于超聲波清洗儀(220 V，500 W)分散處理20 min。

分別取對數(shù)生長期的L-02、HBE細胞以3×105個/mL的濃度接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁后，將細胞分為3組，對照組(正常培養(yǎng)條件，無TiO2-NPs和NAC)，TiO2-NPs(80μg/mL)暴露組、TiO2-NPs(80μg/mL)與NAC(20μmol/L)聯(lián)合暴露組，各組細胞培養(yǎng)72 h后進行檢測。

1.2 過氧化氫檢測

過氧化氫(H2O2)是ROS的主要成分之一，檢測H2O2濃度可在一定程度上反映細胞內(nèi)ROS的生成量。利用過氧化氫檢測試劑盒(碧云天，上海)收集各組細胞進行裂解，取上清液，用酶標儀測定D(560)，依據(jù)H2O2標準曲線計算細胞中H2O2濃度。

1.3 端粒長度測量

利用DNA提取試劑盒(天根，北京)分別提取各組細胞總DNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)進行端粒絕對長度測量，測量基因組拷貝數(shù)的單拷貝基因選用36B4。PCR所需引物、標準品序列及測量及計算方法參考文獻[11]。

1.4 胞質(zhì)分裂阻斷微核細胞組分析

分別收集各組細胞，加入終濃度為4.5μg/mL的細胞松弛素B培養(yǎng)細胞28 h，進行細胞涂片；在光學顯微鏡下計數(shù)凋亡、壞死細胞，計算細胞凋亡率及細胞壞死率；以胞質(zhì)分裂阻斷微核細胞組試驗(cytokinesis-block micronucleus cytome assay，CBMNCyt)分析染色體不穩(wěn)定指標，即計數(shù)至少1 000個雙核細胞(binucleated cell，BNC)中微核(micronuclei，MN)、核質(zhì)橋(nucleoplasmic bridges，NPB)及核芽(nuclear bud，NBud)的數(shù)量，并計算發(fā)生頻率(‰)，三者頻率相加得到細胞的總CIN頻率，方法和指標判別參考文獻[12]。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，使用軟件GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結果

2.1 NAC與TiO2-NPs暴露對L-02、HBE細胞內(nèi)H2O2濃度的影響

H2O2濃度檢測結果顯示，與對照組相比，TiO2-NPs暴露72 h，可顯著誘導L-02、HBE細胞內(nèi)H2O2濃度升高(L-02細胞，P＜0.01；HBE細胞，P=0.04)，當TiO2-NPs聯(lián)合NAC暴露72 h后，L-02和HBE細胞內(nèi)的H2O2濃度仍較對照組顯著升高(L-02細胞，P=0.003；HBE細胞，P=0.006)，而與TiO2-NPs單獨暴露組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1。

2.2 NAC對TiO2-NPs暴露后L-02和HBE細胞端粒長度的穩(wěn)定作用

對端粒長度進行測量后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，TiO2-NPs暴露72 h后可誘導L-02和HBE細胞TL縮短(均為P＜0.01)；而當TiO2-NPs和NAC共同培養(yǎng)72 h后L-02和HBE細胞的TL與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，并且聯(lián)合暴露下的兩種受試細胞TL顯著長于TiO2-NPs單獨暴露組(均為P＜0.01)，見圖2。提示NAC可維持TiO2-NPs暴露下的TL穩(wěn)定。

圖2 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細胞端粒長度的變化

2.3 NAC對TiO2-NPs暴露后L-02和HBE細胞染色體穩(wěn)定性的促進作用

在肝正常L-02細胞和肺正常HBE細胞中，與對照組比較，TiO2-NPs暴露均可顯著增加細胞的CIN(均為P＜0.01)；當NAC與TiO2-NPs聯(lián)合暴露時，L-02和HBE細胞的CIN較各自對照組亦顯著升高(L-02細胞，P=0.025；HBE細胞，P=0.008)。與TiO2-NPs單獨暴露組相比，NAC和TiO2-NPs聯(lián)合暴露組兩種細胞的CIN均顯著降低(L-02細胞，P=0.002；HBE細胞，P=0.03)，見圖3。

圖3 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細胞染色體不穩(wěn)定性的改變

2.4 NAC對TiO2-NPs暴露導致的L-02和HBE細胞死亡的抑制作用

正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞經(jīng)吉姆薩染色制片后，在形態(tài)學上均有顯著差異。正常細胞如圖4A所示，形態(tài)學上凋亡細胞有完整的細胞膜，染色質(zhì)聚集，細胞著色比正常細胞深，細胞核邊界清晰或核分解成核小體，包裹在完整的胞漿或胞膜內(nèi)，并形成大小不一且染色更深的凋亡小體(圖4B)；壞死的細胞在形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞膨脹、細胞膜不完整或直接不存在、細胞核呈無規(guī)則狀且染色較淺(圖4C)。進一步統(tǒng)計分析TiO2-NPs和NAC對受試細胞死亡方式的影響時，研究結果顯示，TiO2-NPs暴露72 h后L-02和HBE細胞死亡(凋亡和壞死細胞總和)率均較對照組顯著增加(L-02細胞，P＜0.01；HBE細胞，P=0.012)，并以細胞壞死方式為主；而NAC與TiO2-NPs聯(lián)合暴露后細胞死亡率較TiO2-NPs單獨暴露組顯著降低(L-02細胞，P=0.004；HBE細胞，P=0.007)，且聯(lián)合暴露組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖4D、F)。值得一提的是，在比較細胞死亡方式時發(fā)現(xiàn)，與TiO2-NPs單獨暴露相比，L-02細胞和HBE細胞中，TiO2-NPs和NAC聯(lián)合暴露組的細胞壞死率均有所減少(圖4E、G)。

圖4 TiO2-NPs與NAC暴露72 h后L-02和HBE細胞死亡情況

3 討論

TiO2-NPs因其良好的著色性以及獨特理化性質(zhì)，已廣泛應用在化妝品、食品加工等領域[12-13]，普遍認為，TiO2-NPs通過誘導細胞產(chǎn)生大量ROS誘發(fā)細胞氧化脅迫，可誘導體外培養(yǎng)細胞微核率升高等效應，表現(xiàn)出遺傳毒性[3-5，14-17]，抗氧化劑對其產(chǎn)生的遺傳毒性具有一定抑制作用[18-19]。端粒作為維護染色體穩(wěn)定性的染色體末端結構，與細胞衰老、基因組不穩(wěn)定性密切相關。當細胞TL改變，將誘導細胞衰老、死亡異常，甚至產(chǎn)生癌變[20]。

本研究首先將人正常肝細胞L-02和肺細胞HBE單獨暴露于TiO2-NPs中，發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs顯著誘導受試細胞內(nèi)H2O2濃度升高，同時TiO2-NPs暴露后，兩株受試細胞均表現(xiàn)出TL縮短、CIN率升高以及壞死率上升。本研究提示TiO2-NPs可誘導細胞產(chǎn)生大量ROS，進而引起細胞氧化脅迫。正是因為端粒作為胞內(nèi)氧化損傷的敏感位點，易被ROS攻擊[21]，因此在TiO2-NPs暴露下受試細胞TL縮短、CIN升高，誘發(fā)端粒紊亂，產(chǎn)生遺傳損傷。

在已確定本研究體系中TiO2-NPs可誘發(fā)受試細胞端粒長度縮短等遺傳損傷的情況下，本研究引入抗氧化劑NAC。當TiO2-NPs與NAC聯(lián)合暴露后，結果發(fā)現(xiàn)，NAC的加入能有效減緩TiO2-NPs暴露后兩種受試細胞表現(xiàn)出的TL縮短、CIN率及細胞壞死率升高，尤其是在NAC與TiO2-NPs共暴露下，兩種受試細胞的TL和細胞死亡率與對照組間的差異均無統(tǒng)計學意義，說明NAC展現(xiàn)了良好的拮抗TiO2-NPs遺傳損傷作用。

NAC是一種在國內(nèi)外許多研究中得到證實的抗氧化物質(zhì)[18，22-23]，已有研究發(fā)現(xiàn)，NAC預處理可明顯降低納米顆粒對離體細胞造成的氧化損傷[9]。同時在體內(nèi)環(huán)境下NAC同樣可抑制TiO2-NPs的毒性作用。Elnagar等[24]證實，喂飼NAC可對TiO2-NPs造成的大鼠睪丸損傷起到一定保護作用，并能改善TiO2-NPs引發(fā)的DNA損傷。Smallcombe等[25]同樣發(fā)現(xiàn)NAC預處理可減少TiO2-NPs引起的小鼠呼吸道損傷。本文結果也提示，體外培養(yǎng)條件下，抗氧化劑NAC可以有效抑制或減緩TiO2-NPs在人正常肝細胞L-02及人正常肺上皮細胞HBE中引發(fā)的TL異常，降低遺傳毒性發(fā)生。

因TiO2-NPs最顯著的毒性效應機制是造成細胞氧化脅迫，進一步誘導細胞產(chǎn)生氧化損傷，在本實驗中，TiO2-NPs暴露引起了受試細胞內(nèi)ROS組分之一的H2O2濃度的顯著升高。然而，研究結果顯示，TiO2-NPs與NAC聯(lián)合暴露并未明顯降低因TiO2-NPs暴露所升高的胞內(nèi)H2O2濃度，一方面可能源于本研究使用的NAC劑量(20μmol/L)及處理時間(72 h)還不足以完全抵抗高劑量TiO2-NPs(80μg/mL)誘導產(chǎn)生的以H2O2為代表的ROS水平，推測NAC對TiO2-NPs誘導的細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的抑制作用可能依賴于抗氧化劑濃度或處理時間；另一方面，作為抗氧化劑，NAC在未降低胞內(nèi)ROS水平的情況下，已經(jīng)發(fā)揮了減緩受試細胞遺傳損傷的效應，NAC究竟通過何種分子機制，在不改變ROS水平前提下有效抑制TiO2-NPs誘導端粒功能紊亂，有待進一步研究。

綜上，本研究選用兩種人組織來源的正常細胞，發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs在人正常肝細胞L-02及人正常肺上皮細胞HBE中暴露72 h后可以導致細胞內(nèi)ROS過量產(chǎn)生并引起細胞端粒功能紊亂；而抗氧化劑NAC可有效抑制TiO2-NPs暴露下誘發(fā)的端粒功能紊亂，促進細胞的染色體穩(wěn)定，阻止細胞死亡。本研究提示，在日常生活中，在避免不了納米顆粒暴露的情況下，補充一定劑量的抗氧化劑如NAC等，可能會降低納米顆粒暴露引起的細胞端粒功能紊亂等遺傳毒性。