饒毅 徐先棟 肖俊 丁立云 傅義龍 萬錦濤 李艷芳

摘要：為提升漁用中草藥應(yīng)用效果，本研究控制中草藥發(fā)酵過程中的含水量、接菌量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度，采用單因素試驗和4因素3水平的正交試驗對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以蒽酮-硫酸法測定中草藥發(fā)酵后的多糖含量，最終確定該中草藥的最佳發(fā)酵工藝為含水量50%，接菌量4%，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間72 h。本研究可為漁用中草藥的發(fā)酵應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：漁用中草藥;乳酸菌;發(fā)酵工藝;多糖含量

中圖分類號：S948? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

漁用中草藥是防治水產(chǎn)動物疾病和改善水產(chǎn)動物體質(zhì)的經(jīng)過加工或未加工的藥用植物、動物或礦物，其中以植物藥占大多數(shù)。中草藥中含有的活性成分主要包含多糖、生物堿、揮發(fā)油、類黃酮、有機酸、單寧等。研究表明，這些活性成分具有增進(jìn)食欲、加快新陳代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、增加酶活性、提高機體免疫力、增強抗病性、提高肌肉品質(zhì)等作用。

發(fā)酵中草藥是將中草藥以優(yōu)選的益生菌作為菌種，通過生物嫁接的方式，在體外模擬腸道環(huán)境和中藥成分在體內(nèi)的消化分解過程，對提取的中藥有效成分進(jìn)行生物學(xué)轉(zhuǎn)化[1]。中草藥經(jīng)發(fā)酵后能提高吸收利用率，增強水生動物的機體免疫力。為了最大程度提升發(fā)酵中草藥應(yīng)用效果，對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化是提高發(fā)酵指標(biāo)的非常有效的技術(shù)手段。本項目利用從草魚腸道中篩選獲得的一株乳酸菌來發(fā)酵復(fù)方中草藥，以多糖含量為指標(biāo)，通過對發(fā)酵過程中的含水量、接種量和發(fā)酵時間等進(jìn)行調(diào)控，確定其最佳發(fā)酵條件，為漁用中草藥的發(fā)酵提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

中草藥原料：大黃、黃柏、黃芩按5∶3∶2的比例混合，備用。

菌種：乳酸乳球菌CR1（本課題組篩選自草魚腸道）。

儀器：超凈工作臺、紫外分光光度計、高壓滅菌鍋、電子天平、生化培養(yǎng)箱

1.2? 試驗方法

1.2.1? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將葡萄糖樣品在105℃烘箱中干燥至恒重，用分析天平稱取10 mg于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。用移液槍分別移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液至具塞比色管內(nèi)，加蒸餾水至1.0 mL。而后各比色管加入硫酸蒽酮溶液（0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸中）6 mL，混勻，置于沸水中加熱15 min，取出放冷水中15 min后于625 nm測其吸光度值。

1.2.2? 中草藥含糖量的測定

稱取烘干至恒重的中草藥樣品0.5 g于250 mL三角燒瓶中，加入45 mL 80%乙醇，靜置浸泡30 min，超聲提取30 min，用濾紙中過濾棄去濾液，將殘渣再次置于250三角燒瓶中重復(fù)上述操作1次。烘干濾渣后加入2%鹽酸45 mL，沸水浴提取1 h，冷卻到室溫后過濾，將濾液置于100 mL容量瓶中，重復(fù)上述操作1次，合并濾液后用2%鹽酸定容，混勻。取1 mL提取液于25 mL容量瓶中，用2%鹽酸定容后取1 mL于比色管中，加入4 mL新配置的硫酸蒽酮溶液，混勻后沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，于625 nm處測其吸光度。經(jīng)測定，中草藥樣品的含糖量為6.64%。

1.2.3? 發(fā)酵菌液的制備

將乳酸乳球菌CR1接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，傳代2次得到活化菌種。將活化菌種以2%接種于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，37℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.4? 中草藥滅菌

將中草藥放入烘箱中烘干后在超凈工作臺中裝入已滅菌的250 mL三角燒瓶中，每個試驗組皆添加27.5 g中草藥粉末，于紫外燈下照射30 min滅菌，備用。

1.2.5? 單因素試驗確定中草藥的發(fā)酵條件

1.2.5.1? 含水量的確定

將已滅菌的中草藥加入無菌水，使含水量分別為40%、50%、60%、70%、80%，每組三個重復(fù)，接菌量為4%，發(fā)酵溫度為37℃，200 r/min搖床振蕩發(fā)酵72 h。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法測定多糖含量，確定最佳發(fā)酵含水量。

1.2.5.2? 接菌量的確定

將已滅菌的中草藥加入無菌水，使含水量達(dá)到50%，之后分別接入2%、4%、6%、8%、10%的發(fā)酵菌液，每組三個重復(fù)，發(fā)酵溫度37℃，200 r/min搖床振蕩發(fā)酵72 h。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法測定多糖含量，確定最佳接菌量。

1.2.5.3? 發(fā)酵溫度的確定

將已滅菌的中草藥加入無菌水，使含水量達(dá)到50%，接菌量為4%，發(fā)酵溫度分別為31℃、33℃、35℃、37℃、39℃，每組三個重復(fù)，200 r/min搖床振蕩發(fā)酵72 h。發(fā)酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法測定多糖含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.5.4? 發(fā)酵時間的確定

將已滅菌的中草藥加入無菌水，使含水量達(dá)到50%，接菌量為4%，發(fā)酵溫度為37℃，200 r/min搖床振蕩分別發(fā)酵24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，發(fā)酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法測定多糖含量，確定最佳發(fā)酵時間。

1.2.6? 正交試驗優(yōu)化中草藥發(fā)酵條件

單因素試驗確定了中草藥發(fā)酵的最佳含水量、接菌量、溫度和時間，在此基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平的正交試驗，發(fā)酵后放入烘箱中烘干，按1.2.2方法測定多糖含量，以此優(yōu)化最佳發(fā)酵方案。

1.3? 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

2? 結(jié)果與分析

2.1? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度所測結(jié)果繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到回歸方程：y=101.33x-0.0251，R2 =0.9964。

2.2? 含水量對發(fā)酵中草藥的影響

含水量對發(fā)酵中草藥的影響如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)含水量為50%時，發(fā)酵中草藥的多糖含量最高，含水量低于50%時，發(fā)酵后多糖含量隨著含水量的升高而升高，當(dāng)含水量高于50%時，發(fā)酵后多糖含量隨著含水量的升高呈下降趨勢。因此，單因素條件下選擇50%為最佳含水量。

2.3? 接菌量對發(fā)酵中草藥的影響

接菌量對發(fā)酵中草藥的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)接菌量為4%時，發(fā)酵中草藥的多糖含量最高，接菌量為2%～4%時，發(fā)酵后多糖含量隨著接菌量的升高而升高，當(dāng)接菌量高于4%時，發(fā)酵后多糖含量又逐漸下降。因此，單因素條件下選擇4%為最佳接菌量。

2.4? 發(fā)酵溫度對發(fā)酵中草藥的影響

發(fā)酵溫度對發(fā)酵中草藥的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵溫度升高，發(fā)酵后多糖含量也隨之升高，當(dāng)達(dá)到35℃時，發(fā)酵中草藥的多糖含量最高，溫度升高多糖含量又呈下降趨勢。因此，單因素條件下選擇35℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.5? 發(fā)酵時間對發(fā)酵中草藥的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵中草藥的影響如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵時間在24～72 h時，多糖含量逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵時間繼續(xù)延長時，多糖含量隨之下降，但變化不明顯。因此單因素條件下選擇72 h為最佳發(fā)酵時間。

2.6? 正交試驗優(yōu)化中草藥的發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗確定各因素的水平值，開展4因素3水平的正交試驗，試驗因素和水平見表1，正交試驗方案和結(jié)果見表2，方差分析的結(jié)果見表3。

由表2可知，4個因素對發(fā)酵中草藥的多糖含量影響主次順序為：A（含水量）>D（發(fā)酵時間）>B（接菌量）>C（發(fā)酵溫度），發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即發(fā)酵中草藥的最佳工藝為含水量50%，接菌量4%，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間72 h。由表3可知，含水量對多糖含量影響顯著（P<0.05），接菌量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對多糖含量無顯著影響（P>0.05）。

3? 討論

發(fā)酵是指通過微生物的生長、培養(yǎng)或化學(xué)變化，產(chǎn)生大量和積累代謝產(chǎn)物的過程[2]。為了提高代謝產(chǎn)物中有效成份的含量，對發(fā)酵過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化控制是最重要的方法。傳統(tǒng)微生物發(fā)酵憑主觀經(jīng)驗控制，如制作豆豉、釀酒等，主要就是控制溫度、濕度等，不能保證發(fā)酵過程的穩(wěn)定。而現(xiàn)代微生物發(fā)酵的全過程利用現(xiàn)代生物技術(shù)對發(fā)酵的工藝條件（發(fā)酵菌種、溫度、濕度、pH和時間等）進(jìn)行監(jiān)控，提高對有效成分的提取率。李嘉懿等[3]利用益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥，優(yōu)化其發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量、發(fā)酵時間等工藝參數(shù)，結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，發(fā)酵中藥液的多糖得率是優(yōu)化前的1.65倍，未發(fā)酵的2.51倍。郭舒等[4]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥，通過試驗確定最佳發(fā)酵工藝，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下，含糖量得到顯著提高，并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響極顯著，含水量的影響顯著，接菌量的影響不顯著。不同的研究中最佳的發(fā)酵工藝也存在著差異。宋玉卓等[5]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵復(fù)方中草藥，結(jié)果表明接菌量對發(fā)酵結(jié)果影響顯著，含水量和發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果無顯著影響，這可能是因為發(fā)酵的中草藥不同對發(fā)酵工藝產(chǎn)生了影響。本研究也與上述兩個研究存在著差異，結(jié)果表明含水量影響顯著，接菌量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間無顯著影響，因為本研究在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)隨著含水量的提高，中草藥在發(fā)酵過程中會出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，對發(fā)酵結(jié)果影響較大。

參考文獻(xiàn)

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[3]李嘉懿，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，等. 益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥產(chǎn)多糖的工藝優(yōu)化[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2018，33（3）：5.

[4]郭舒，刁新平，宋玉卓，等. 復(fù)方中草藥飼料添加劑發(fā)酵工藝的研究[J]. 飼料工業(yè)，2015，36（5）：4.