方漢林，黃云龍，張仁泉

食管癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道[1]，2020年全球食管癌新發(fā)病例數(shù)60.4萬(wàn)，死亡數(shù)達(dá)到54.4萬(wàn)。我國(guó)食管癌的發(fā)病率居第5位，病死率居第4位[2]。目前，手術(shù)治療聯(lián)合輔助放化療仍是食管癌的有效治療手段。但是，食管癌的5年存活率仍較低，約為30%～40%[3]。其中，約90%的食管癌為鱗狀細(xì)胞癌[3]。鱗狀細(xì)胞癌是一種高度轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)和侵襲的上皮細(xì)胞惡性腫瘤。然而，關(guān)于食管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子學(xué)機(jī)制尚不清楚。SPIB是Ets家族轉(zhuǎn)錄因子的成員，位于19q染色體上，其在成熟B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化和漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究表明，在肝細(xì)胞癌[6]、B細(xì)胞淋巴瘤[7]和非小細(xì)胞肺癌[8-10]中，SPIB是重要的預(yù)后因子，高表達(dá)SPIB患者的生存預(yù)后較差。SPIB通過(guò)調(diào)控SNAP47蛋白表達(dá)，進(jìn)一步介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌的自噬過(guò)程[9]。Zhao et al[11]研究表明，與癌旁組織比較，食管癌中SPIB呈現(xiàn)高表達(dá)水平。然而，關(guān)于SPIB調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，該研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)闡明SPIB對(duì)食管癌增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器食管癌細(xì)胞(KYSE150、KYSE450、KYSE30)和食管正常上皮細(xì)胞(Het-1a)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；敲低組siSPIB-1/2 和對(duì)照組(siNC)購(gòu)自上海生工生物有限公司；pCDH-SPIB及空載體購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；SPIB抗體購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞(KYSE150、KYSE450、KYSE30)和食管正常上皮細(xì)胞(Het-1a)采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2。

1.2.2siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 在6孔板中接種KYSE150細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%，進(jìn)行siRNA(或質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染：將50 pmol siRNA(或2.5 μg質(zhì)粒)和5 μl lipofectamine 2000 分別加入到2支含50 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基的離心管中進(jìn)行混勻，并將siRNA(或質(zhì)粒)液體加入到轉(zhuǎn)染試劑中混勻。室溫放置5 min后，將上述混合液均勻加入到每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)。通過(guò)加入嘌呤霉素(2 μg/ml)篩選，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SPIB的食管癌細(xì)胞系。siSPIB-1/2序列F：5′-GG ACCTATGGACCACTATACT-3′，R： 5′-CAAGGTTCCC TCTTGTCAGAT-3′。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測(cè) 細(xì)胞密度按照3×103個(gè)/孔在96孔板上接種KYSE150細(xì)胞并培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)染siSPIB-1/2和siNC，或接種Vector組和SPIB組KYSE30細(xì)胞。不同時(shí)間后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)孵育2 h。使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司)測(cè)定吸光度值(450 nm)。以siNC組為參考，計(jì)算相對(duì)細(xì)胞增殖率。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 當(dāng)KYSE150細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同轉(zhuǎn)染處理后，按照5×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，換成含0.5% 胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h。再用黃色槍頭在孔板底部劃出平行的劃痕，并用PBS洗去漂浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.2.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用美國(guó)Corning公司的Transwell系統(tǒng)，在小室底部預(yù)鋪基質(zhì)膠(稀釋比例為 6 ∶1)。將經(jīng)過(guò)不同轉(zhuǎn)染處理后的KYSE150細(xì)胞稀釋成細(xì)胞懸液(2×106個(gè)/ml)，在6孔板內(nèi)加入600 μl 含15%胎牛血清的培養(yǎng)基，在小室內(nèi)加入100 μl 上述細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。接下來(lái)，對(duì)小室的外面細(xì)胞進(jìn)行染色：采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行室溫固定，15 min后采用PBS洗滌，采用1%結(jié)晶紫染料進(jìn)行染色，擦去小室的內(nèi)面細(xì)胞。使用顯微鏡進(jìn)行圖像采集。

1.2.6細(xì)胞周期檢測(cè) 將KYSE150細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，分別轉(zhuǎn)染siNC和siSPIB-1/2。48 h后，胰酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)：首先采用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，然后用70%預(yù)冷乙醇固定，24 h后用預(yù)冷的PBS溶液洗滌2次，使用500 μl PI溶液進(jìn)行染色，并避光孵育30 min(37 ℃)。用CytoFLEX流式細(xì)胞儀和CyExpert軟件分析染色細(xì)胞。采用Flow Jo軟件分析細(xì)胞周期G1/G0、S和G2/M期的細(xì)胞百分比。

1.2.7克隆形成實(shí)驗(yàn) 將已構(gòu)建好的穩(wěn)定表達(dá)SPIB的KYSE30細(xì)胞系，細(xì)胞密度按照250個(gè)/孔接種于6孔板中。2周后，去除培養(yǎng)基，使用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入中性福爾馬林固定15 min，棄去固定液，加入結(jié)晶紫染色液染色15 min。使用PBS洗去多余的結(jié)晶紫染色液，并采用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 采用預(yù)冷的RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)裂解細(xì)胞10 min，以14 000 r/min離心5 min取上清液，即蛋白溶液。蛋白溶液通過(guò)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度。取35 μg蛋白加入到SDS-PAGE膠(10%)中進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。接下來(lái)，將PVDF膜置于5%脫脂奶進(jìn)行封閉90 min后，棄去封閉液并與一抗孵育過(guò)夜(4 ℃)。使用TBS-T溶液洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或鼠的二抗并孵育(室溫)。使用TBS-T溶液洗滌3次后，在目標(biāo)條帶位置加超敏感化學(xué)發(fā)光顯色液，通過(guò)使用數(shù)字成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.9qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞內(nèi)總RNA使用細(xì)胞或組織RNA分離純化(FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation)試劑盒提取，并經(jīng)HiScript II Q RT SuperMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。SPIB引物F：5′-ACCATGCTCGCCCTGGA-3′，R：5′-GGCT AGCGAAGTTCTCC-3′；GAPDH引物F:5′-AGGTCG GTGTGAACGGATTTG-3′，R：5′-GGGGTCGTTGATG GCAACA-3′。

2 結(jié)果

2.1 SPIB在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響與食管正常上皮細(xì)胞Het-1a比較，KYSE150等3株食管癌細(xì)胞系中SPIB mRNA和蛋白表達(dá)上升(P=0.000 1，F(xiàn)=126.90；圖1A、B)。進(jìn)一步采用siRNA干擾技術(shù)分析，2條siRNA-SPIB均能有效地下調(diào)KYSE150細(xì)胞內(nèi)SPIB蛋白表達(dá)(圖1C、D)。因此，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)SPIB表達(dá)可減弱KYSE150細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48 h：P=0.009 0，F(xiàn)=29.76；72 h：P<0.000 1，F(xiàn)=89.51；圖1E)。

圖1 SPIB在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)情況及其低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 過(guò)表達(dá)SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，成功在KYSE30細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)SPIB蛋白(P<0.000 1，t=64.19；圖2A、B)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)SPIB促進(jìn)KYSE30細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(48 h：P= 0.000 1，t=14.06；72 h：P=0.000 7，t=9.363；圖2C)。SPIB亦增強(qiáng)KYSE30細(xì)胞的克隆形成能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 0，t=7.15；圖2D、E)。

圖2 過(guò)表達(dá)SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響

2.3 下調(diào)SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞周期和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響為進(jìn)一步了解SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞周期的調(diào)控能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：敲低食管癌細(xì)胞內(nèi)SPIB表達(dá)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞G1/G0期捕獲，降低S和G2/M期細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A、B，表1)。同時(shí)，下調(diào)表達(dá)SPIB進(jìn)一步降低KYSE150細(xì)胞內(nèi)Cyclin D1蛋白表達(dá)(圖3C)。

圖3 下調(diào)SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞周期和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

表1 下調(diào)SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞周期的影響

2.4 下調(diào)SPIB蛋白表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化能力的影響敲低KYSE150細(xì)胞內(nèi)SPIB表達(dá)，可減弱細(xì)胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1，F(xiàn)= 305.00；圖4A、B)。Transwell實(shí)驗(yàn)表明，siSPIB可抑制KYSE150細(xì)胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004 7，F(xiàn)= 29.57；圖4C、D)。為進(jìn)一步了解SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，通過(guò)Western blot檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果敲低SPIB表達(dá)，可以增加KYSE150細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)，但減弱了N-cadherin蛋白的表達(dá)(圖4E)。

圖4 SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

食管癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。雖然聯(lián)合手術(shù)與放化療能顯著提高患者的生存預(yù)后，但是5年總生存率仍然較低。因此，通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)闡明食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有利于今后的抗食管癌治療。SPIB作為Ets家族轉(zhuǎn)錄因子的成員之一，在調(diào)控成熟B細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Ho et al[6]研究表明結(jié)腸、肝臟和胃癌組織中SPIB蛋白表達(dá)水平顯著高于非腫瘤組織。研究[6, 8]表明，SPIB在肝癌和非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體腫瘤中是重要的預(yù)后因子。

Zhao et al[11]通過(guò)對(duì)8例配對(duì)食管癌和癌旁正常組織進(jìn)行GeneChip分析，發(fā)現(xiàn)了22個(gè)差異化表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，其中高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子為：SPIB、BRCA1、MZF1、MAFG和NFE2L1，這提示SPIB可能作為一個(gè)促癌因子，調(diào)控食管癌增殖轉(zhuǎn)移。為驗(yàn)證上述推測(cè)，本研究首先檢測(cè)了食管癌細(xì)胞系和正常食管上皮細(xì)胞中SPIB表達(dá)水平，結(jié)果顯示食管癌細(xì)胞中SPIB的mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于食管上皮細(xì)胞。因此，推測(cè)SPIB可能是一個(gè)促癌因子，調(diào)控食管癌發(fā)展。由于在三株食管癌細(xì)胞系中，KYSE150細(xì)胞中SPIB表達(dá)最高，進(jìn)行siRNA敲低實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，同時(shí)能更好反映SPIB對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；而KYSE30細(xì)胞中SPIB表達(dá)最低，siRNA干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)提示下調(diào)SPIB效果不明顯，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故進(jìn)行SPIB過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。此外，選擇不同細(xì)胞系進(jìn)行正反方向驗(yàn)證，可避免細(xì)胞系選擇單一而引起的結(jié)果偏差。分別通過(guò)siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式，下調(diào)和上調(diào)食管癌細(xì)胞中SPIB表達(dá)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)SPIB增強(qiáng)食管癌細(xì)胞增殖速度和克隆形成能力。敲低SPIB表達(dá)可顯著抑制Cyclin D1蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞停滯于G1期。遷移侵襲是食管癌的另一個(gè)惡性生物學(xué)行為。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell系統(tǒng)檢測(cè)了SPIB低表達(dá)對(duì)食管癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為的影響，結(jié)果顯示敲低SPIB表達(dá)可顯著抑制食管癌遷移侵襲。研究[8, 10]表明過(guò)表達(dá)SPIB可促進(jìn)皮下移植瘤的肺部轉(zhuǎn)移，并顯著降低模型小鼠的總生存率[10]。研究[8]表明SPIB可通過(guò)靶向抑制緊密連接蛋白Claudin-2轉(zhuǎn)錄而抑制肺癌的早期轉(zhuǎn)移。本研究中，敲低SPIB表達(dá)可以增加食管癌細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)，但抑制N-cadherin蛋白表達(dá)。因此，SPIB可通過(guò)調(diào)節(jié)E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)，介導(dǎo)食管癌細(xì)胞的遷移侵襲能力。SPIB作為新發(fā)現(xiàn)的促癌轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)眾多促癌因子起到正向調(diào)節(jié)作用。但在食管癌中，SPIB是否能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式調(diào)節(jié)促癌或抑癌因子表達(dá)，進(jìn)一步影響食管癌的惡性行為需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，SPIB在食管癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，可促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，SPIB可能是今后食管癌診療的潛在靶點(diǎn)之一。