李雅嫻，李永翔

Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因(Bcl-2-associated athanogenes，BAGs)家族編碼的蛋白是一個(gè)多功能的協(xié)同蛋白聚糖組，其編碼蛋白與Bcl-2家族蛋白無氨基酸同源序列，是一種新的非Bcl-2家族的Bcl-2結(jié)合蛋白，與已知在細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡途徑中起作用的不同結(jié)合配偶體相互作用[1]。6個(gè)BAG家族成員共享一個(gè)進(jìn)化保守序列——“BAG結(jié)構(gòu)域”，這些編碼蛋白通過該結(jié)構(gòu)域各自與分子伴侶——70 ku熱休克蛋白(heatshockprotein70，HSP70)相互作用[2]。事實(shí)上，雖然BAG蛋白可以與Bcl-2相互作用，增強(qiáng)其抗凋亡作用，但是其主要功能仍然是作為HSP70的輔助伴侶控制蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。此外，由于BAG蛋白可以與Bcl-2相互作用并增加其抗凋亡能力，所以可以進(jìn)一步推測(cè)BAG具有致癌作用[3]，因此，BAGs成為目前癌癥研究的焦點(diǎn)，對(duì)該家族的研究可能會(huì)有助于推進(jìn)未來癌癥的靶向治療發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理2021年4月8日，從UCSC Xena數(shù)據(jù)庫的GDC TCGA集中下載了包括33種腫瘤類型的11 057例樣本數(shù)據(jù)，其中包括該基因家族的表達(dá)譜、表型信息以及存活數(shù)據(jù)[4]。另外，從數(shù)據(jù)庫中獲得了所有患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、腫瘤信息和隨訪數(shù)據(jù)。在本研究中，TCGA腫瘤的33種類型和縮寫采用國(guó)際通用說法。

1.2 腫瘤與正常組織中BAGs的差異表達(dá)分析和共表達(dá)分析對(duì)于下載的原始數(shù)據(jù)，本研究使用“ggpubr”R包通過Wilcox 檢驗(yàn)對(duì)腫瘤和正常組織之間的差異表達(dá)進(jìn)行分析，在呈現(xiàn)的熱圖結(jié)果中，6個(gè)BAG家族基因在泛癌中的表達(dá)差異以log2倍變化的形式呈現(xiàn)。另外，本研究利用“corrplot” R包在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)BAG家族基因之間進(jìn)行共表達(dá)分析[5]，闡明每?jī)蓚€(gè)BAG基因之間的潛在表達(dá)模式。

1.3 臨床相關(guān)性分析根據(jù)下載的原始數(shù)據(jù)中的中位表達(dá)水平，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，再利用R包分析表達(dá)高水平和低水平BAGs基因的患者之間的總體生存結(jié)果的差異，從而生成了泛癌中BAGs基因的生存分析圖(Kaplan-Meier plots)。同時(shí)，應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸來評(píng)估每個(gè)腫瘤類型中BAG1、BAG2、BAG3、BAG4、BAG5和BAG6的風(fēng)險(xiǎn)比。

1.4 免疫亞型分析根據(jù)腫瘤的6種免疫亞型(C1～C6)：傷口愈合型(C1)、IFN-γ主導(dǎo)型(C2)、炎癥型(C3)、淋巴細(xì)胞殆盡型(C4)、免疫靜默型(C5)和TGF-β主導(dǎo)型(C6)，評(píng)估了TGCA腫瘤類型中6種不同免疫亞型的BAG家族的mRNA表達(dá)水平，并用Kruskal檢驗(yàn)進(jìn)行了差異表達(dá)分析。

1.5 干細(xì)胞指標(biāo)與泛癌微環(huán)境使用“estimate”R包和“l(fā)imma”R包在6個(gè)BAG基因的表達(dá)水平和基質(zhì)細(xì)胞得分之間進(jìn)行Spearman相關(guān)分析[6]，并使用一類邏輯回歸(one-class logistic regression ,OCLR)算法計(jì)算了TCGA腫瘤樣本的干細(xì)胞指數(shù)，并基于基因表達(dá)和干細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行了Spearman 相關(guān)分析[7]，干細(xì)胞指數(shù)包括DNAss和RNAss[8]。具體而言，本研究應(yīng)用了RNAss、DNAss、基質(zhì)細(xì)胞得分、免疫細(xì)胞得分和綜合得分(基質(zhì)細(xì)胞得分和免疫細(xì)胞得分的代數(shù)和)，分析與PPAR轉(zhuǎn)錄表達(dá)的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用R 軟件4.0.3進(jìn)行分析，熱圖以logFC的變化值表示，生存分析圖用Kaplan-Meier plots表示，風(fēng)險(xiǎn)比用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸評(píng)估，差異表達(dá)分析用Kruskal檢驗(yàn)表示，Spearman相關(guān)分析用OCLR表示，在箱式圖、生存曲線圖和Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸圖中，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤與正常組織中BAGs家族基因的差異表達(dá)分析和共表達(dá)分析圖1的箱式圖顯示了BAGs家族基因表達(dá)，圖2、3采用秩和檢驗(yàn)對(duì)腫瘤和正常組織之間的6個(gè)BAG基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果表明，這6個(gè)基因在所有類型的腫瘤中表達(dá)有高有低，但是BAG6在絕大多數(shù)類型腫瘤中高表達(dá)。由圖2、3可知，與正常組織比較，BAG6只有在KICH中低表達(dá)，在其他腫瘤中均高表達(dá)；同時(shí)，除了BAG3在CHOL中低表達(dá)，其他BAG家族基因在CHOL中均呈現(xiàn)高表達(dá)。另外，值得注意的是，在腫瘤與正常組織表達(dá)差異比較分析中發(fā)現(xiàn)，腎部腫瘤KIRC和KIRP在BAG1、BAG2、BAG3、BAG4中均呈現(xiàn)低表達(dá)，但是在BAG6中卻表現(xiàn)出高表達(dá)。而且，肺部腫瘤LUAD和LUSC在BAG2、BAG3、BAG4、BAG6中均高表達(dá)，但在BAG1中卻是低表達(dá)。

圖1 BAGs家族基因表達(dá)箱式圖

圖2 BAG基因家族在腫瘤中表達(dá)熱圖

圖4的共表達(dá)分析表明，BAG基因家族兩兩之間都存在正相關(guān)性，BAG5和BAG6之間的相關(guān)系數(shù)為0.73，這說明兩者有較強(qiáng)相關(guān)性。同時(shí)，BAG1和BAG6、BAG2和BAG5、BAG3和BAG6、BAG3和BAG5、BAG4和BAG5、BAG5和BAG6也都表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。

圖4 BAG基因家族共表達(dá)相關(guān)系數(shù)圖

2.2 臨床相關(guān)性分析本研究對(duì)TCGA中的33種腫瘤進(jìn)行了BAGs家族基因的生存分析(Kaplan-Meier analysis)，由圖5可知，BAG1的低表達(dá)與KIRC患者的不良預(yù)后顯著相關(guān) (P<0.001)，相對(duì)應(yīng)地，BAG1在KIRC中腫瘤較正常組織低表達(dá)。相反，BAG2表達(dá)升高與LIHC 患者的較差臨床結(jié)果相關(guān)(P<0.001)，這也與腫瘤與正常組織差異表達(dá)結(jié)果相一致。由于通常Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸可用于檢測(cè)基因在腫瘤中的預(yù)后作用，并將危險(xiǎn)比>1的基因視為一個(gè)危險(xiǎn)預(yù)后因素，所以BAG1對(duì)于PCPG是一個(gè)危險(xiǎn)預(yù)后因素，BAG2對(duì)于KICH、THCA和UVM是危險(xiǎn)預(yù)后因素。見圖6。

圖5 腫瘤中BAG高表達(dá)和BAG低表達(dá)的生存曲線圖

圖6 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸圖

2.3 免疫亞型分析通過對(duì)腫瘤的6種免疫亞型中BAGs家族基因表達(dá)進(jìn)行差異表達(dá)分析可知，BAG1、BAG2、BAG3、BAG4、BAG5和BAG6的表達(dá)模式在泛癌中的6種免疫亞型中存在差異(均P<0.001)。結(jié)果顯示，BAG6在C1～C6的整體表達(dá)水平上排名第一，BAG2在C1～C6的整體表達(dá)水平最低。見圖7。

圖7 C1～C6免疫亞型中BAGs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖

2.4 干細(xì)胞指標(biāo)與腫瘤微環(huán)境對(duì)于DNAss、LGG和BAG家族基因之間普遍存在負(fù)相關(guān)，如，BAG1(r=-0.246，P<0.001)、BAG4(r=-0.200，P<0.001)、BAG6(r=-0.197，P<0.001)均與LGG呈負(fù)相關(guān)。另外，THYM和不同的基因相關(guān)情況有所不同，BAG1(r=-0.320，P<0.001)和BAG6(r=-0.529，P<0.001)與THYM呈負(fù)相關(guān)，BAG3(r=0.503，P<0.001)和BAG4(r=0.347，P<0.001)與THYM呈正相關(guān)。見圖8A。

圖8 BAG家族與干細(xì)胞指數(shù)和微環(huán)境評(píng)分的相關(guān)分析結(jié)果圖

對(duì)于RNAss，TGCT和BAGs之間普遍存在相關(guān)性，TGCT RNAss和BAG1(r=-0.448，P<0.001)呈負(fù)相關(guān)，和BAG2(r=0.296，P<0.001)、BAG4(r= 0.464，P<0.001)、BAG5(r=0.282，P<0.001)以及BAG6(r=0.335，P<0.001)均呈正相關(guān)。另外，LUSC RNAss和BAG之間也存在普遍正相關(guān)性，LUSC RNAss和BAG1(r=0.154，P<0.001)、BAG2(r=0.286，P<0.001)、BAG4(r=0.270 ，P<0.001)和BAG5(r=0.196 ，P<0.001)均呈現(xiàn)正相關(guān)。見圖8B。

本研究發(fā)現(xiàn)BAG2的表達(dá)與多種腫瘤類型呈正相關(guān)，包括BLCA、BRCA、CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC和PAAD等，這表明BAG2的高表達(dá)與多種腫瘤的低純度有關(guān)。同時(shí)，BAG2和BAG6與腫瘤純度的關(guān)系存在顯著差異，BAG2的高表達(dá)與絕大多數(shù)腫瘤的高腫瘤純度相關(guān)，而BAG6的模式相反。見圖8C。

3 討論

本研究探討了BAGs家族的表達(dá)轉(zhuǎn)錄與泛癌的一系列相關(guān)性，包括腫瘤微環(huán)境、臨床意義、免疫亞型和干細(xì)胞微環(huán)境。在對(duì)包括TCGA的33個(gè)腫瘤的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，各個(gè)BAG基因在不同腫瘤中的表達(dá)存在差異，在后續(xù)生存分析中顯示，在某些腫瘤中，高表達(dá)的BAG基因和低表達(dá)的BAG基因患者生存時(shí)間存在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，這說明了BAG基因很有可能可以作為一個(gè)腫瘤臨床預(yù)后指標(biāo)。此外，根據(jù)研究者先前確定的C1～C6免疫亞型[9]，本研究通過代表性免疫特征對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)它們都具有差異表達(dá)，這些免疫特征與細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤脈管系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞一起構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的概念，其異質(zhì)性高度影響治療反應(yīng)和臨床預(yù)后[10]。因此，本研究通過基質(zhì)細(xì)胞得分、免疫細(xì)胞得分和綜合得分，進(jìn)一步獲得了33種TCGA腫瘤樣本中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，結(jié)果說明這些TME特征與BAG1～6的表達(dá)水平相關(guān)。據(jù)報(bào)道[11]，細(xì)胞干性可以用來描述腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞樣特征:自我更新和去分化，而且在許多腫瘤進(jìn)展中發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞樣特性的獲得[12]，因此，在本研究中利用了OCLR方法計(jì)算腫瘤樣本的RNAss評(píng)分和DNAss評(píng)分，然后將其與BAGs的轉(zhuǎn)錄特征相關(guān)聯(lián)，表明BAGs基因可能在高干細(xì)胞維持中起作用。

已有研究[13]表明，BAGs家族可以與Bcl-2蛋白相互作用并增加其抗凋亡能力,故其在腫瘤生成、發(fā)展以及預(yù)后過程中均可能發(fā)揮作用。由本研究的結(jié)果可知，BAG基因?qū)σ恍┠[瘤的預(yù)后和生存有指導(dǎo)意義，說明其可能可以作為這些癌癥的臨床生物標(biāo)記物，給癌癥的診斷和治療提供可視化幫助。另外，本研究中BAGs家族與腫瘤微環(huán)境和基質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系提示后續(xù)相關(guān)研究可以從體外研究入手，從而將對(duì)BAG蛋白有效的化療藥物或者放療方法通過納米載體等方式直接作用于腫瘤組織，達(dá)到事半功倍的治療效果。此外，研究[12]表明，BAGs家族蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)錄和遷移，結(jié)合本研究中該家族中不同蛋白在不同免疫亞型中的表達(dá)不同這一結(jié)果，啟發(fā)未來相關(guān)研究者可以通過檢測(cè)不同的免疫亞型分子來對(duì)該家族基因進(jìn)行合理檢驗(yàn)，從而使腫瘤在早期得以診斷。

綜上所述，通過對(duì)BAG1～6的多維分析揭示了BAGs家族在泛癌水平上的各種表達(dá)模式，表明了BAG基因可能可作為多種癌癥的潛在診斷和預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物，并可能會(huì)為患者術(shù)后個(gè)體化治療提供理論支持。