范懿雋，史于傳，李 君，董 振，詹 磊

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，約占全部生殖道惡性腫瘤的20%～30%，2018年全球新發(fā)病例有38萬例左右[1]。不同地區(qū)的發(fā)病率不同，但均隨著人口老齡化有逐步增加的趨勢[2]。外科手術結(jié)合放化療是目前最常見的子宮內(nèi)膜癌臨床治療方法，鉑類和紫杉醇聯(lián)合治療是一線化療方案[3]。但是，子宮內(nèi)膜癌尤其是晚期患者的諸多放化療并發(fā)癥以及不良預后嚴重困擾著臨床醫(yī)生，亟待尋找新的藥物和改良治療方法以提高患者的生存率。研究[4]發(fā)現(xiàn)，某些天然藥物能夠通過多種途徑如介導AMKP磷酸化增強等來調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細胞自噬，細胞自噬的增強能夠抑制癌細胞的生長并促進癌細胞凋亡。白藜蘆醇是一種多酚，在葡萄和漿果等植物中自然產(chǎn)生。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在人體可發(fā)揮多種功能，如抗炎、改善葡萄糖代謝和提高胰島素敏感性等。它還具有心臟保護、神經(jīng)保護、抗血栓和抗癌作用。目前對于白藜蘆醇在子宮內(nèi)膜癌中的作用研究較少，該研究擬通過觀察其對于子宮內(nèi)膜癌細胞自噬的調(diào)控作用，探討白藜蘆醇在子宮內(nèi)膜癌治療中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑白藜蘆醇購于美國Sigma公司，Beclin1、LC3B、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT抗體購于美國Abcam公司，HRP標記的二抗購于美國Affinity公司，PVDF膜購于上海Biosharp公司，ECL購于美國Pierce公司、CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司，LC3 引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，其它常規(guī)試劑購于武漢博士德生物工程有限公司或美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株(美國Sigma公司)由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院實驗室保存，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1% 青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，細胞在含有5% CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。細胞消化處理并種植于6孔板中，待其生長至70%～80%隨機分為對照組、白藜蘆醇組和白藜蘆醇+PI3K激動劑(740Y-P)組，其中白藜蘆醇濃度為100 μmol/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行相關檢測。

1.3 白黎蘆醇對Ishikawa細胞的增殖抑制作用本研究采用梯度濃度(0、25、50、100、200 μmol/L)的白藜蘆醇分別處理Ishikawa細胞24、48、72 h，通過CCK-8實驗檢測白藜蘆醇對Ishikawa細胞增殖能力的影響。具體步驟如下：將0、25、50、100、200 μmol/L白藜蘆醇處理的Ishikawa細胞分別于24、48、72 h接種在96孔板中，每孔2×103個細胞，每組3個復孔，待細胞貼壁后每孔中加10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定450 mm處吸光度值表示各組細胞的增殖情況，實驗重復3次，以實驗測得的均值為實驗結(jié)果。

1.4 電鏡觀察自噬小體Ishikawa細胞接種于6孔板中，三組細胞處理后培養(yǎng)24 h，用細胞刮刀收集細胞樣本，經(jīng)過戊二醛鋨酸固定、梯度乙醇丙酮脫水、浸透、包埋、高溫聚合、修塊、半薄切片、染色、定位、超薄切片和醋酸鈾檸檬酸鉛染色等過程，將細胞樣本制作成為超薄切片，置于透射電子顯微鏡下，觀察細胞內(nèi)自噬體的變化并拍照記錄。

1.5 Western blot法使用RIPA裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度，配置10%或15%的10孔膠，每孔加入10 μl的樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂奶粉封閉，然后TBST洗膜3次，每次10 min。按說明書孵一抗過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，按說明書孵二抗1 h，TBST清洗3次，每次10 min，ECL發(fā)光，顯影，以GAPDH為內(nèi)參，觀測各蛋白的相對表達量。

1.6 qRT-PCR法收集加藥培養(yǎng)后的細胞，按照說明書使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，測定RNA 濃度，再利用提取RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green試劑盒開始qRT-PCR，每組樣本重復3次。GADPH 引物序列上游引物:5′-GGTTGAGCAGGTACTTT-3′，下游引物:5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′；Beclin1 引物序列上游引物:5′-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3′，下游引物:5′-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3′；LC3 引物序列上游引物:5′-AGCAGCATCCAACCAAAATC-3′，下游引物:5′-CTGTGTCCGTTCACCAACAG-3′。

1.7 免疫熒光Ishikawa細胞接種于6孔板中，三組細胞處理后培養(yǎng)24 h，然后開始細胞爬片，接著使用丙酮固定，固定后用PBS洗滌2次，每次10 min，山羊血清封閉，滴加抗LC3抗體過夜孵育，PBS清洗后滴加熒光二抗，使用抗熒光淬滅劑固封，最后在激光共聚顯微鏡下攝片。

2 結(jié)果

2.1 白黎蘆醇抑制Ishikawa細胞增殖在50 μmol/L濃度的白藜蘆醇培養(yǎng)下，Ishikawa細胞的增殖能力與對照組相比下降(P<0.01)；100 μmol/L和200 μmol/L白藜蘆醇作用下的Ishikawa細胞增殖能力與同一時段50 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但100 μmol/L和200 μmol/L白藜蘆醇對細胞的抑制作用比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；表明培養(yǎng)基中添加白藜蘆醇對Ishikawa細胞的增殖有抑制作用，并且在濃度為100 μmol/L培養(yǎng)24 h抑制率最高，經(jīng)計算白藜蘆醇的半數(shù)抑制濃度(the half maximal inhibitory concentration,IC50)為94.35 μmol/L，因此，本研究采用100 μmol/L的濃度培養(yǎng)細胞24 h用于后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 Ishikawa細胞白藜蘆醇作用敏感性檢測

2.2 白藜蘆醇處理可引起Ishikawa細胞自噬白藜蘆醇組細胞超微結(jié)構可見細胞核皺縮，胞質(zhì)可見自噬小體，小體內(nèi)包裹即將被降解的細胞器，而對照組未見細胞核皺縮和自噬小體。見圖2。

圖2 Ishikawa細胞超微結(jié)構 ×13 500

2.3 白藜蘆醇上調(diào)自噬相關蛋白Beclin1和LC3 mRNA水平與對照組比較，白藜蘆醇組Ishikawa細胞Beclin1(t=2.533,P<0.05)和LC3 mRNA水平升高(t=9.131,P<0.01)。見圖3。

圖3 兩組Beclin1與LC3 mRNA水平比較

2.4 白藜蘆醇上調(diào)自噬相關蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白水平Wester blot檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，白藜蘆醇組Ishikawa細胞Beclin1(t=6.258,P=0.003)和LC3-Ⅱ(t=7.489，P=0.002)蛋白水平也升高，見圖4。采用免疫熒光法檢測Ishikawa細胞LC3蛋白熒光強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇組Ishikawa細胞質(zhì)LC3蛋白紅色熒光強度強于對照組，見圖5。

圖4 兩組Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白水平比較

圖5 兩組LC3-Ⅱ蛋白表達比較 ×400

2.5 白藜蘆醇下調(diào)P-PI3K和P-AKT蛋白水平Wester blot檢測發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇組Ishikawa細胞P-PI3K(t=3.937，P=0.017)和P-AKT(t=3.502，P=0.025)蛋白水平低于對照組。見圖6。

圖6 兩組PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT 蛋白水平比較

2.6 740Y-P抑制白藜蘆醇誘導的自噬與白藜蘆醇組比較，白藜蘆醇+740Y-P組Ishikawa細胞Beclin1(t=8.439,P<0.001)和LC3 mRNA水平降低(t=7.860,P<0.01),見圖7。進一步的檢測發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇+740Y-P組Ishikawa細胞Beclin1(t=6.817,P=0.002)和LC3-Ⅱ(t=7.846,P<0.01)蛋白水平也低于白藜蘆醇組，見圖8。白藜蘆醇組細胞超微結(jié)構可見細胞核皺縮，胞質(zhì)可見自噬小體，小

圖7 三組Beclin1與LC3 mRNA水平比較

圖8 三組Beclin1與LC3-Ⅱ蛋白水平比較

體內(nèi)包裹即將被降解的細胞器，而白藜蘆醇+740Y-P組未見細胞核皺縮和自噬小體，見圖9。采用免疫熒光法檢測Ishikawa細胞LC3蛋白熒光強度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇組Ishikawa細胞質(zhì)LC3蛋白紅色熒光強度強于白藜蘆醇+740Y-P組，見圖10。

圖9 Ishikawa細胞超微結(jié)構 ×13 500

圖10 三組LC3-Ⅱ熒光水平比較 ×400

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征、不孕、初潮年齡早和絕經(jīng)年齡晚是潛在的危險因素。子宮內(nèi)膜癌的主要發(fā)病人群是圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女[5]。因子宮內(nèi)膜癌篩查方法的局限性及部分患者癥狀易與圍絕經(jīng)期異常子宮出血相混淆，未及時就診導致在中晚期才被發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的外科手術結(jié)合放化療并不能滿足晚期患者治療的需要[1]。天然分子在癌癥化學療法中越來越受到關注，因其與靶位點的結(jié)合作用更強，對正常細胞的毒性更小[6]。

自噬是一種保護性的分解代謝過程，通過回收細胞器和大分子來維持細胞環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。在這個過程中，有缺陷或老化的細胞器和其他細胞質(zhì)成分被包裹在雙囊泡內(nèi)形成自噬體。自噬體與溶酶體融合，囊泡內(nèi)容物被溶酶體酶降解為氨基酸、脂類和碳水化合物。降解產(chǎn)物被重新利用產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)和細胞器[8]。Beclin1是一種自噬形成過程中的信號蛋白，通過與第三類磷酸肌醇3激酶復合物的相互作用，在自噬體前體形成的過程中，發(fā)揮著巨大的作用[9]。LC3通常有LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ兩種形式，可溶性的LC3-Ⅰ通過轉(zhuǎn)化形式LC3-Ⅱ來參與自噬囊泡轉(zhuǎn)運相關的過程[10]。研究[11]表明，自噬在各種疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用，包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤、感染和免疫缺陷等。因此，將自噬作為治療靶點在多種疾病中具有潛在意義。重要的是，已有研究[12]表明自噬對子宮內(nèi)膜癌細胞的生長有抑制作用。因此，尋找促進自噬水平的方法將有利于子宮內(nèi)膜癌治療。

作為一種抗毒素多酚，白藜蘆醇能夠參與多種生理和病理過程，有研究[13]表明白藜蘆醇可以抑制白血病的發(fā)生和發(fā)展，更重要的是，在有效的抗癌劑量下，白藜蘆醇對體內(nèi)外正常組織的細胞毒性作用很小，這反映了白藜蘆醇在癌癥治療中的潛在價值。然而白藜蘆醇對子宮內(nèi)膜癌是否有治療作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可降低Ishikawa細胞的增殖速度，隨著白藜蘆醇濃度的增加和其作用時間的延長，其對細胞生長抑制作用也逐漸增加，說明白藜蘆醇對子宮內(nèi)膜癌細胞具有殺傷效應，且其作用呈現(xiàn)濃度與時間依賴性。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇組與對照組比較，細胞中自噬相關蛋白和其RNA 水平增加；通過細胞免疫熒光檢測，白藜蘆醇作用于Ishikawa細胞后，細胞核內(nèi)的LC3藍色熒光未見區(qū)別，而細胞質(zhì)LC3紅色熒光強度增強，提示自噬可能參與了白藜蘆醇的抗腫瘤作用，作用靶點主要位于細胞質(zhì)。然而白藜蘆醇調(diào)控自噬的機制未明。有研究[14]表明，白藜蘆醇能夠通過PI3K/AKT信號通路對細胞的增殖遷移等活動進行調(diào)控。PI3K/AKT信號通路作為調(diào)控細胞生長的主要通路，其上調(diào)和下調(diào)對細胞的增殖等方面有著重要的意義。而且，PI3K/AKT信號通路的激活也會抑制自噬的發(fā)生[15-16]。因此，猜測在子宮內(nèi)膜癌中白藜蘆醇可能通過影響PI3K/AKT通路的激活調(diào)控自噬的水平進而發(fā)揮抗腫瘤作用。通過加入白藜蘆醇的實驗組與對照組比較，白藜蘆醇作用于Ishikawa細胞后，細胞中P-PI3K和P-AKT蛋白水平下降，提示白藜蘆醇可以抑制PI3K/AKT信號通路的激活。聯(lián)合使用PI3K激動劑(740Y-P)后發(fā)現(xiàn)，740Y-P能夠降低白藜蘆醇誘導的自噬作用，通過Western Blot 、qRT-PCR、免疫熒光和電鏡等實驗方法對其進行了驗證。這說明白藜蘆醇可以通過抑制PI3K/AKT通路的激活來誘導Ishikawa細胞的自噬，進而抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。

綜上所述，本研究證實白藜蘆醇通過抑制PI3K/AKT信號通路，促進子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生自噬，從而導致增殖抑制，給子宮內(nèi)膜癌治療提供了新的思路，未來可能成為子宮內(nèi)膜癌輔助治療的新藥物。