高永勝，劉 娜，邵 國(guó)，閆少春，白 靜

腎細(xì)胞癌是全球十大常發(fā)的癌癥之一[1]，腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是其主要組織學(xué)類型，大約占所有腎細(xì)胞癌病例的75%，是導(dǎo)致腎細(xì)胞癌死亡的主要類型之一[2]。為了解ccRCC腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子變化，研究者對(duì)ccRCC組織基因組、表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)ccRCC是多基因引起的，包括各種腫瘤抑制基因的丟失、VHL基因的異常失調(diào)等變化[3-4]。因此了解ccRCC的基因表達(dá)變化，對(duì)于明確ccRCC突出的分子學(xué)表征有一定特征的價(jià)值和臨床意義。高通量測(cè)序又被稱為下一代測(cè)序，可用于篩選和鑒定通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的可能的疾病治療潛在靶點(diǎn)[5]。該研究利用ccRCC和癌旁組織，通過(guò)高通量測(cè)序找出差異表達(dá)的基因，利用生物信息學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行部分驗(yàn)證，以期為ccRCC發(fā)病機(jī)制和治療提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料RNAeasy mini kit試劑盒購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白BCA定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；鼠源ATP5F1抗體(sc-514419)和鼠源β-actin(sc-47778)抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；PVDF膜購(gòu)于美國(guó)羅氏生物公司；RIPA裂解液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物合成于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1ccRCC樣本 取包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的ccRCC患者的樣本，包括ccRCC組織和相應(yīng)的癌旁組織，腫瘤組織病理檢測(cè)證實(shí)均為第Ⅱ期的樣本。患者年齡38～75歲，術(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。排除有嚴(yán)重的急性感染或同時(shí)患有其他腫瘤的患者。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2.2ccRCC的生物信息學(xué)分析 ccRCC組織和癌旁組織共兩組樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行mRNA表達(dá)的高通量測(cè)序，差異表達(dá)結(jié)果在美吉生物云平臺(tái)(https://www.cloud.majorbio.com)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取50 mg ccRCC樣本組織，使用RNAeasy mini kit試劑盒提取總RNA，并使用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBR染料法檢測(cè)各組ATP5F1和β-actin mRNA情況，根據(jù)2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列ATP5F1 F：5′-AGGTCCAGGGGTATTGCAG-3′，R：5′-TCCTCAGGGATCAGTCCATAAC-3′；β-actin F：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′,R：5′-GGTCATTGATGGCAACAA-3′。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 使用RIPA裂解液提取ccRCC和癌旁組織的總蛋白質(zhì)，使用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，每組蛋白樣品取10 μg加入聚丙烯酰胺凝膠各泳道中，5%濃縮膠19 mA電泳30 min，12%分離膠29 mA電泳3 h后，使用轉(zhuǎn)膜儀400 mA轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，將ATP5F1和β-actin一抗1 ∶1 000稀釋，4 ℃過(guò)夜孵育，TBST清洗3次，山羊抗鼠二抗1 ∶1 000稀釋孵育1 h，加入ECL發(fā)光并使用化學(xué)發(fā)光儀采集圖像[6]。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC的生物信息學(xué)分析與癌旁組織比較，ccRCC差異表達(dá)的基因有14 016個(gè)(圖1)，其中表達(dá)升高的基因有1 421個(gè)，表達(dá)降低的基因有12 595個(gè)。通過(guò)KEGG對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，有251個(gè)基因涉及癌癥，其中非小細(xì)胞肺癌的52個(gè)，膠質(zhì)瘤的58個(gè)，前列腺癌的70個(gè)，癌癥膽堿代謝的71個(gè)(圖2)。通過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因涉及多條代謝通路，包括脂質(zhì)氧化、乙酰輔酶A代謝等過(guò)程(圖3)。

圖1 ccRCC和癌旁組織基因差異表達(dá)火山圖

圖2 ccRCC和癌旁組織基因差異表達(dá)KEGG富集分析圖

圖3 ccRCC和癌旁組織基因差異表達(dá)GO富集分析圖

2.2 ccRCC表達(dá)基因分析對(duì)ccRCC中高表達(dá)的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較增加2倍的有60個(gè)基因，其中涉及ATP代謝有40個(gè)(表1)。主要包括ATPase H+transporting V0 亞單位、ATP synthase peripheral stalk亞單位、ATP synthase membrane 亞單位、ATP synthase F1亞單位等。

表1 ccRCC中表達(dá)增加倍數(shù)前20的基因列表

2.3 ccRCC中ATP5F1表達(dá)情況由于ATP5F1有商業(yè)化的抗體，本研究通過(guò)檢測(cè)ATP5F1對(duì)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行研究。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)ccRCC組織和癌旁組織ATP5F1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)(圖4A)，利用β-actin作為內(nèi)參。與癌旁組織比較，ccRCC的ATP5F1 mRNA相對(duì)豐度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.016，P=0.007)；利用Western blot對(duì)ccRCC組織和癌旁組織ATP5F1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)(圖4B、C)。與癌旁組織比較，ATP5F1蛋白變化與mRNA相一致，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.229,P=0.002)。

圖4 ccRCC組織ATP5F1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)以及生物信息學(xué)分析的飛速發(fā)展，通過(guò)大數(shù)據(jù)分析某些或某類基因在疾病中的作用，可以為疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和治療評(píng)價(jià)等研究提供新的思路。癌細(xì)胞表現(xiàn)出氧化還原狀態(tài)和代謝的改變，這些變化與線粒體有關(guān)，因?yàn)榫€粒體是活性氧生成和能量代謝的主要位置[7]。本研究利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)ccRCC和癌旁組織進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)ATP合成酶相關(guān)的基因在ccRCC中高表達(dá)。

腎細(xì)胞癌是一種代謝性疾病，其特征是：參與氧敏感的代謝途徑失調(diào)(VHL/HIF途徑改變)；能量傳感(Warburg位移增強(qiáng)脂肪生成；降低AMPK和三羧酸循環(huán))和營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)級(jí)聯(lián)(AMPK-TSC1/2-mTOR和PI3K-Akt-mTOR通路的調(diào)節(jié))[8]。本研究通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)ccRCC與癌旁組織比較有14 016個(gè)差異表達(dá)基因，而高表達(dá)的基因中與ATP合成酶相關(guān)的有40個(gè)。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot對(duì)其中的ATP5F1進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示ATP5F1在ccRCC中高表達(dá)。proteinatlas網(wǎng)站顯示，877例腎癌患者中，ATP5F1A高表達(dá)的為655例，ATP5F1B高表達(dá)的為688例。ATP5F1B是ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運(yùn)，線粒體Fo復(fù)合物，亞基B1，是核基因編碼的線粒體蛋白[9]。Brüggemann et al[9]研究發(fā)現(xiàn)ATP合成酶表達(dá)改變與ccRCC患者的總生存率相關(guān)，可能是ccRCC患者預(yù)后的重要因素。而proteinatlas網(wǎng)站顯示ATP5F1高表達(dá)的ccRCC患者5年和10年的生存率更高。研究[10]表明癌細(xì)胞與正常細(xì)胞不同，即使是在有足夠氧氣的情況下，它們主要通過(guò)糖酵解來(lái)代謝葡萄糖。索拉非尼是一種廣譜多激酶抑制劑，被證明可有效治療晚期腎細(xì)胞癌和肝癌，其作用機(jī)制是抑制電子傳輸鏈和ATP合酶的復(fù)合物Ⅱ/Ⅲ的活性[11]。到目前為止，關(guān)于ccRCC中電子傳遞鏈蛋白質(zhì)亞基表達(dá)變化的報(bào)道和研究很少。因此通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)電子傳遞鏈中的ATP合成酶基因表達(dá)上調(diào)，為闡明電子傳遞鏈在ccRCC中的作用提供了一個(gè)線索。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)ccRCC患者樣本有多種基因表達(dá)改變，其中ATP合成酶的多個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ATP5F1的變化與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，ATP5F1有6種亞單位，本研究只對(duì)整體的ATP5F1進(jìn)行了驗(yàn)證。文獻(xiàn)和生物信息學(xué)網(wǎng)站顯示ATP5F1高表達(dá)的ccRCC患者5年和10年生存率更高，由于電子傳遞鏈基因在ccRCC發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的作用尚不明確，需要通過(guò)以后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)找出電子傳遞鏈基因的變化在ccRCC發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的作用機(jī)制，為臨床治療ccRCC的治療提供潛在分子靶點(diǎn)。