丁庭庭,潘李萌,楊 光,楊 婧,鐘 興,潘天榮

全球糖尿病患病率在未來將繼續(xù)增加，預(yù)計(jì)到2045年，全球糖尿病患者數(shù)將達(dá)到6.93億[1]。糖尿病常常伴有多種并發(fā)癥，其中糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，與糖尿病患者的高發(fā)病率與死亡率相關(guān)，是終末期腎衰竭最常見的病因之一[2]。DKD是一種以腎小球超濾及腎小球電荷和通透性改變?yōu)橹鞯募膊。鼇硌芯縖3-4]表明腎小管損傷機(jī)制可能在DKD的病理生理中起重要作用，DKD患者腎功能下降與腎小管結(jié)構(gòu)改變包括腎小管萎縮、腎小管間質(zhì)纖維化等有關(guān)。鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制劑——達(dá)格列凈可通過抑制腎臟對葡萄糖的重吸收、促進(jìn)尿糖排泄降低血糖，并且對DKD有保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚不清楚。該研究通過棕櫚酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙及氧化應(yīng)激模型，使用達(dá)格列凈干預(yù)后檢測腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能、氧化應(yīng)激及凋亡情況的變化，探討達(dá)格列凈對DKD的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自美國Actt公司； DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；PBS緩沖液購自美國Hyclone公司；0.25%含EDTA胰酶消化液購自上海源培公司；棕櫚酸購自美國Sigma公司(批號：P0500)；達(dá)格列凈購自南京百鑫德諾生物科技公司(批號：BMS512148)；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；Hoechst 33258染色細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海貝博公司；JC-1染色線粒體膜電位檢測試劑盒、DCHF-DA細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、細(xì)胞線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物公司；β-actin購自美國Engibody公司、caspase3、Cleaved caspase3、Cytochrome C抗體購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HK-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，同時加1%青-鏈霉素，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)70%～80%時傳代。選取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組：正常對照(CON)組，含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液對HK-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；棕櫚酸(PA)組，使用棕櫚酸濃度為150 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)HK-2細(xì)胞[5]；棕櫚酸+達(dá)格列凈(PA+Dapa)組，使用棕櫚酸濃度為150 μmol/L和達(dá)格列凈濃度為2 μmol/L的培養(yǎng)液進(jìn)行HK-2細(xì)胞培養(yǎng)；達(dá)格列凈(Dapa)組，使用含2 μmol/L達(dá)格列凈的培養(yǎng)液對HK-2細(xì)胞培養(yǎng)[6]。

1.2.2CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖力 在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100 μl/孔)，每孔約3 000個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)生長至接近單層時，給與相應(yīng)的刺激，處理結(jié)束后每孔加入100 μl含有10% CCK-8的工作液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光值。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測 HK-2細(xì)胞呈對數(shù)生長時，將細(xì)胞懸液滴加到6孔板中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞接近長成單層并給與相應(yīng)刺激，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光染料至終濃度為10 μmol/L，將染料加入6孔板中，每孔1 ml，均勻覆蓋細(xì)胞表面，將6孔板放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，棄去染料，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，然后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.4細(xì)胞線粒體膜電位的檢測 將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，給與相應(yīng)刺激后，吸出6孔板中的培養(yǎng)液，使用PBS沖洗1次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液和1 ml JC-1染色工作液，充分混勻后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱里避光孵育20 min，使用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，使用熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.5Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞玻片放置于12孔板中，將對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞以1×105個/孔的細(xì)胞密度接種于12孔板，給予相應(yīng)藥物干預(yù)后，按照Hoechst33258染色試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，最后使用熒光顯微鏡采集圖像。

1.2.6細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 HK-2細(xì)胞使用藥物干預(yù)后，在6孔板中加入100 μl /孔的裂解液冰上裂解30 min，然后收集樣品于EP管中，使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測量樣品的蛋白濃度用于計(jì)算，根據(jù)說明書檢測細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA含量。

1.2.7Western Blot法檢測細(xì)胞凋亡蛋白 細(xì)胞及線粒體成分中加入適量的裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、13 200 r/min離心30 min，取上清用BCA蛋白定量檢測試劑盒測量相應(yīng)蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度加入適量的蛋白樣品(約30 μg/泳道)于SDS-PAGE進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉室溫慢搖封閉2 h，封閉結(jié)束后放置于提前使用一抗稀釋液稀釋的一抗中，4 ℃孵育過夜，次日使用TBST液快搖洗滌10 min×3次，二抗孵育1 h后再用TBST快搖洗滌10 min×3次，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)格列凈對棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的增殖力的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：四組間細(xì)胞活力水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.87，P<0.01)；與CON組比較，PA組HK-2細(xì)胞的活力下降(P<0.05)，而Dapa組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組細(xì)胞活力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組HK-2細(xì)胞增殖力的情況

2.2 達(dá)格列凈對棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)的影響DCF免疫熒光結(jié)果顯示：四組間ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=405.4,P<0.01)；與CON組比較，PA組綠色熒光增強(qiáng)，提示ROS水平增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Dapa組HK-2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組HK-2細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度減弱，提示ROS水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的情況 ×200

2.3 達(dá)格列凈對棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響JC-1熒光染色結(jié)果顯示：四組間線粒體膜電位水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.05,P<0.01)；與CON組比較，PA組紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值降低(P<0.05)，提示線粒體膜電位降低，而Dapa組紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值升高(P<0.05)，提示膜電位水平升高。見圖3。

圖3 各組HK-2細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化 ×200

2.4 HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化SOD、MDA檢測試劑盒檢測結(jié)果顯示：四組間SOD、MDA水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.0、26.02,均P<0.01)；與CON組SOD、MDA水平比較[(154.40±6.43) U/mgprot、(0.63±0.13) nmol/mgprot]，PA組細(xì)胞內(nèi)SOD水平(109.97±3.37) U/mgprot降低，MDA水平(2.01±0.31) nmol/mgprot升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Dapa組SOD及MDA水平[(141.75±5.08) U/mgprot、(0.93±0.15) nmol/mgprot]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組SOD水平(125.32±5.58) U/mgprot上升，MDA水平(1.33±0.17) nmol/mgprot下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組HK-2細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA水平變化

2.5 HK-2細(xì)胞內(nèi)凋亡水平的變化Hoechast33258凋亡染色結(jié)果顯示：四組間凋亡水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=244.0,P<0.01)；與CON組比較，PA組凋亡染色熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞凋亡水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組凋亡染色熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞凋亡水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組HK-2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡水平的變化 ×200

2.6 HK-2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白和Cyto C蛋白的變化Western Blot結(jié)果顯示：四組間caspase3、Cleaved caspase3、Cyto C蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.51、179.8、132.3,均P<0.01)；與CON組比較，PA組凋亡蛋白caspase3、Cleaved caspase3水平上升，胞漿Cyto C蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PA組比較，PA+Dapa組caspase3、Cleaved caspase3及Cyto C水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組HK-2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白、Cyto C蛋白表達(dá)量情況

3 討論

DKD是慢性高血糖所致的慢性腎臟損害，臨床上以持續(xù)白蛋白尿和腎小球?yàn)V過率進(jìn)行性下降為主要特征，進(jìn)而發(fā)展為終末期腎病。DKD的治療主要包括控制體質(zhì)量、血壓和血糖等，以延緩終末期腎病的發(fā)展。達(dá)格列凈是屬于SGLT2抑制劑的新型降糖藥物，SGLT在體內(nèi)以主動轉(zhuǎn)運(yùn)的形式逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，參與腎臟對葡萄糖的重吸收。SGLT2表達(dá)于腎臟近曲小管，具有低親和力、高轉(zhuǎn)運(yùn)能力，在腎臟重吸收約90%的葡萄糖。研究[7]表明，SGLT2抑制劑每天增加尿葡萄糖排泄約70～80 g，降低HbA1c約0.5%～0.8%。臨床研究[7]結(jié)果顯示，達(dá)格列凈治療降低了白蛋白尿，并且其降低白蛋白尿的作用很大程度上與血糖、血壓及體質(zhì)量的降低無關(guān)，這表明達(dá)格列凈具有降糖之外的腎臟保護(hù)作用。另一項(xiàng)隨機(jī)交叉實(shí)驗(yàn)的事后分析發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈降低了白蛋白尿，并且使腎小管損傷標(biāo)志物Kim和炎癥因子IL-6排泄減少，達(dá)格列凈降低蛋白尿的作用可能是由于腎小球內(nèi)壓力或腎小管細(xì)胞損傷減少所致[8]。本研究使用棕櫚酸刺激體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，結(jié)果示棕櫚酸可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞增殖力降低，檢測凋亡水平增加，達(dá)格列凈干預(yù)后細(xì)胞凋亡明顯改善，提示達(dá)格列凈可改善棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞增殖力,降低細(xì)胞凋亡。

糖脂代謝異常是糖尿病最主要的疾病特征，近年來研究[9-10]認(rèn)為2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制與脂肪酸代謝紊亂導(dǎo)致的機(jī)體胰島素抵抗、胰島素分泌異常、糖代謝受損關(guān)系密切，游離脂肪酸升高被認(rèn)為是誘發(fā)2型糖尿病的重要原因。同時，異位脂質(zhì)(脂質(zhì)在非脂肪組織中的積累)與系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和近端腎小管上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能變化有關(guān)，是導(dǎo)致腎臟損害的重要原因[11]。目前DKD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與高血糖、微循環(huán)障礙、糖代謝異常、脂代謝異常及氧化應(yīng)激有關(guān)。近來研究[12]表明，DKD的發(fā)生可能與線粒體功能障礙有關(guān)。而氧化磷酸化系統(tǒng)在線粒體內(nèi)膜上發(fā)生，若內(nèi)膜一旦被破壞，磷酸化解偶聯(lián)和電子傳遞系統(tǒng)完全失去運(yùn)作平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生；同時，發(fā)生氧化應(yīng)激時，可引起線粒體功能損傷加重。實(shí)驗(yàn)研究[13]發(fā)現(xiàn)高糖使得體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞線粒體斷裂，線粒體膜電位降低，同時伴有線粒體蛋白Drp1和Fis1的表達(dá)增加，融合蛋白Mfn2表達(dá)降低。以上研究提示，在糖尿病模型中存在線粒體功能障礙。本研究通過體外培養(yǎng)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞，使用棕櫚酸處理后結(jié)果顯示HK-2細(xì)胞凋亡增加，表現(xiàn)為線粒體膜電位下降，產(chǎn)生過量的ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生；同時胞漿Cyto C蛋白表達(dá)量增加，提示線粒體損傷膜通透性增加，從而使Cyto C從線粒體釋放至胞漿，激活caspase引起凋亡。

達(dá)格列凈對腎臟保護(hù)作用的潛在機(jī)制可能是多方面的。有研究[14]報(bào)道，使用達(dá)格列凈干預(yù)胰島素抵抗的代謝綜合征大鼠模型后，大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位升高、ROS減少及Ca2+穩(wěn)態(tài)得到良好控制，提示達(dá)格列凈通過改善線粒體功能及氧化應(yīng)激對代謝綜合征大鼠的心臟進(jìn)行保護(hù)作用。另一項(xiàng)體外研究[15]表明，達(dá)格列凈可以降低高葡萄糖所致的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS、IL-8、TGF-β水平及對高葡萄糖觸發(fā)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，提示達(dá)格列凈可改善腎小管氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化。Takagi et al[5]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂喂養(yǎng)的小鼠中，近端腎小管出現(xiàn)空泡化、擴(kuò)張和上皮細(xì)胞脫離，同時體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，在高糖和棕櫚酸刺激下表現(xiàn)為線粒體明顯損傷，使用伊格列凈改善了上述癥狀。本研究結(jié)果同樣顯示，達(dá)格列凈可以提高棕櫚酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞線粒體膜電位，降低ROS水平及氧化應(yīng)激水平，使HK-2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白水平降低，對棕櫚酸干預(yù)的HK-2細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，達(dá)格列凈使棕櫚酸干預(yù)的HK-2細(xì)胞線粒體功能及氧化應(yīng)激水平得到改善，提示達(dá)格列凈可能通過改善線粒體功能障礙及氧化應(yīng)激水平對DKD進(jìn)行保護(hù)作用。