劉蘭， 張東雪， 朱榮芳， 李暉， 梁向楠， 張勝雷， 白亞玲

敲減表達(dá)通過上調(diào)p53/DRAM1信號通路促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬和凋亡*

劉蘭， 張東雪， 朱榮芳， 李暉， 梁向楠， 張勝雷， 白亞玲△

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊 050011）

探討賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8（SET domain-containing protein 8）低表達(dá)通過p53/DRAM1（DNA damage-regulated autophagy modulator 1）通路調(diào)控大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）自噬和凋亡的作用及機(jī)制。體外原代培養(yǎng)大鼠VSMCs，敲減表達(dá)，將細(xì)胞分為3組：正常組、空載體對照組和SET8-shRNA組。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，MTT法檢測細(xì)胞活力，Western blot檢測SET8、p53、DRAM1、LC3、Bax和Bcl-2的蛋白水平。過表達(dá)，將大鼠VSMCs分為3組：正常組、空載體對照組和DRAM1組。檢測各組細(xì)胞活力，凋亡及DRAM1、LC3、Bax和Bcl-2的蛋白水平。敲減表達(dá)的同時(shí)敲減或表達(dá)，觀察LC3、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。（1）敲減表達(dá)后，大鼠VSMCs凋亡顯著增多，活力顯著降低（<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，敲減表達(dá)后，SET8和Bcl-2表達(dá)顯著降低（<0.05），p53、DRAM1、LC3-II和Bax表達(dá)顯著升高（<0.05）。（2）過表達(dá)后，大鼠VSMCs凋亡顯著增多（<0.05），活力顯著降低（<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)后，DRAM1、LC3-II和Bax表達(dá)顯著升高（<0.05），Bcl-2表達(dá)顯著降低（<0.05）。（3）敲減或表達(dá)后，LC3-II和Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高（<0.05）。敲減表達(dá)可促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，可能機(jī)制是通過上調(diào)p53和DRAM1表達(dá)，促進(jìn)自噬蛋白LC3-II及凋亡蛋白Bax表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

血管平滑肌細(xì)胞；SET8蛋白；DRAM1蛋白；自噬；細(xì)胞凋亡

血管鈣化是增加心血管疾病發(fā)病率和死亡率的重要危險(xiǎn)因素［1-2］。血管鈣化的重要機(jī)制有細(xì)胞的自噬、凋亡、表型轉(zhuǎn)化等［3-4］。SET8 （SET domain-containing protein 8）是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的唯一能夠特異性催化H4賴氨酸20位的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠甲基化p53和Twist等非組蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡等生理學(xué)功能［5］。自噬基因（DNA damage-regulated autophagy modulator 1）是p53下游調(diào)節(jié)自噬和凋亡的基因，2006年由Crighton等［6］提出，可調(diào)節(jié)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞的自噬和凋亡。作為DRAM依賴的一種自噬凋亡途徑，自噬能夠作為一種細(xì)胞死亡程序，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡及肝損傷［7］?，F(xiàn)今SET8和DRAM1在大鼠血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells， VSMCs）自噬和凋亡中的作用研究均較少，并且機(jī)制尚不明確。鑒于此，本項(xiàng)工作以體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對象，探討SET8是否通過p53/DRAM1通路調(diào)控大鼠血管平滑肌細(xì)胞的自噬和凋亡。

材料和方法

1　主要實(shí)驗(yàn)試劑

選取胎牛血清（Gibco）；SET8質(zhì)粒和DRAM1質(zhì)粒（廣州復(fù)能基因有限公司）；Lipofectamine? 3000（Invitrogen）；SET8抗體（Abcam）；DRAM1和LC3抗體（華安生物技術(shù)有限公司）；Bcl-2和Bax抗體（Abcam）；GAPDH抗體（Bioworld）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組選取河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的健康雄性清潔級SD大鼠（證書號：1305090）6只，8～10周齡，體重80～100 g，做原代培養(yǎng)［8］。取胸主動(dòng)脈中膜層，剪成小塊，均勻鋪于平底進(jìn)行培養(yǎng)。取第3～4代細(xì)胞，給與刺激。將大鼠VSMCs分為3組：（1）正常normal）組：細(xì)胞未轉(zhuǎn)染；（2）對照（vector）組：轉(zhuǎn)染濃度為2 μg/L的對照NS-shRNA質(zhì)粒；（3）SET8-shRNA組：轉(zhuǎn)染濃度為2 μg/L的SET8-shRNA質(zhì)粒。檢測細(xì)胞自噬及凋亡情況。為驗(yàn)證DRAM1對VSMCs自噬及凋亡的影響，將大鼠VSMCs分為3組：（1）normal組：細(xì)胞未轉(zhuǎn)染；（2）vector組：轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒，濃度為2 μg/L；（3）DRAM1組：轉(zhuǎn)染DRAM1過表達(dá)質(zhì)粒，濃度為2 μg/L。檢測細(xì)胞自噬及凋亡情況。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力取第3代大鼠血管平滑肌細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合達(dá)60%～70%給予刺激，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。檢測前4 h將5 g/L的MTT 按每孔20 μL加入各檢測孔中，培養(yǎng)4 h，之后棄去培養(yǎng)液，將二甲基亞砜按每孔150 μl加入各檢測孔，室溫振蕩10 min。于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度（）值，記錄結(jié)果。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡收集大鼠血管平滑肌細(xì)胞，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行Annexin V-PE/7-AAD雙重染色，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，右下象限Annexin V陽性、7-AAD陰性，為早期凋亡細(xì)胞；右上象限Annexin V和7-AAD均為陽性，為晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4應(yīng)用 Western blot檢測各指標(biāo)蛋白的表達(dá)提取各組大鼠VSMCs的蛋白質(zhì)，配制成12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，測蛋白濃度并取20 μg蛋白質(zhì)加樣，電泳條件95 V、1.5 h。使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件95 V、1 h。洗膜3次，牛血清白蛋白（5%）封閉1 h。加Ⅰ抗稀釋液（SET8， 1∶500； DRAM1， 1∶1 000； LC3， 1∶1 000； Bax， 1∶2 000； Bcl-2， 1∶1 000； p53， 1∶2 000； GAPDH， 1∶5 000），4 ℃孵育過夜；次日洗膜，加入II抗稀釋液（1∶5 000），37 ℃孵育1 h。使用蛋白成像系統(tǒng)照膜，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證SET8對p53和DRAM1的調(diào)節(jié)作用，在大鼠VSMCs中轉(zhuǎn)染SET8-shRNA，并在轉(zhuǎn)染SET8-shRNA的同時(shí)共轉(zhuǎn)染p53-shRNA和DRAM1-shRNA，vector作為對照組，觀察VSMCs凋亡和自噬蛋白的表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，提取蛋白，檢測Bax、Bcl-2和LC3蛋白表達(dá)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls（SNK）檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　敲減SET8對大鼠VSMCs凋亡的影響

給予敲減表達(dá)后，采用Annexin V-PE/7-AAD染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的變化情況。結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，SET8-shRNA組細(xì)胞凋亡顯著增多（<0.05），見圖1。

Figure 1.Effect of SET8 knockdown on apoptosis of rat VSMCs. A： flow cytometry results； B： percentage of apoptotic cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

2　敲減SET8對大鼠VSMCs活力的影響

MTT結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，SET8-shRNA組細(xì)胞活力于12 h、24 h、36 h和48 h均顯著降低（<0.05）；normal組與vector組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見圖2。

Figure 2.Effect of SET8 knockdown on rat VSMCs viability. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

3　敲減SET8表達(dá)后對各組大鼠VSMCs p53、DRAM1、LC3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，SET8-shRNA組SET8和Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著降低，p53、DRAM1、LC3-II和Bax蛋白相對表達(dá)量顯著升高（<0.05），見圖3。

Figure 3.Effect of SET8 knockdown on the protein expression of p53， DRAM1， LC3， Bcl-2 and Bax in rat VSMCs in each group. A： Western blot results for each protein； B： relative protein expression. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

4　過表達(dá)DRAM1對大鼠VSMCs凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，DRAM1組細(xì)胞凋亡顯著增多（<0.05），見圖4。

Figure 4.Effect of overexpression of DRAM1 on apoptosis of rat VSMCs. A： flow cytometry results； B： percentage of apoptotic cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

5　DRAM1對大鼠VSMCs活力的影響

MTT結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，DRAM1組細(xì)胞活力于12 h、24 h、36 h和48 h均顯著降低（0.05）；normal組與vector組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05），見圖5。

Figure 5.Effect of overexpression of DRAM1 on the viability of rat VSMCs. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

6　DRAM1過表達(dá)對各組大鼠VSMCs LC3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與normal組和vector組比較，DRAM1組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著降低，DRAM1、LC3-II和Bax蛋白相對表達(dá)量顯著升高（<0.05），見圖6。

Figure 6.Effects of overexpression of DRAM1 on the expression of LC3， Bcl-2 and Bax proteins in rat VSMCs. A： Western blot results for each protein； B：r elative protein expression. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal group； #P<0.05 vs vector group.

7　SET8-shRNA與p53-shRNA和DRAM1-shRNA共轉(zhuǎn)染

與vector組比較，將SET8-shRNA轉(zhuǎn)染至VSMCs后，Bax及LC3-II蛋白表達(dá)增高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（0.05）；與SET8-shRNA組比較，SET8-shRNA與p53-shRNA共同轉(zhuǎn)染VSMCs后，Bax及LC3-II蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高（0.05）；與SET8-shRNA組比較，SET8-shRNA與DRAM1-shRNA共同轉(zhuǎn)染VSMCs后，Bax及LC3-II蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高（0.05），見圖7。

Figure 7.Effects of co-transfection of SET8-shRNA with p53-shRNA or DRAM1-shRNA on the expression of Bax， Bcl-2 and LC3 proteins. A： Western blot results for each protein； B： relative protein expression. 1： vector group； 2： SET8-shRNA group； 3： SET8-shRNA+p53-shRNA group； 4，SET8-shRNA+DRAM1-shRNA group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs vector group； #P<0.05 vs SET8-shRNA group.

討論

血管鈣化是心血管疾病死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［9］。而細(xì)胞的凋亡、自噬和表型轉(zhuǎn)化等是引起血管鈣化的重要機(jī)制［10-11］。參與細(xì)胞凋亡和自噬的通路有多種。本項(xiàng)工作以體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞為研究對象，探討SET8調(diào)控大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生機(jī)制。研究結(jié)果顯示SET8低表達(dá)可誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡，其可能機(jī)制是通過促進(jìn)p53及DRAM1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8可以特異性單甲基化抑癌基因的382賴氨酸位點(diǎn)（K382me1），能夠抑制的靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)功能［12-13］。而抑癌基因參與細(xì)胞生存和分裂的控制，對細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞周期有重大的影響［14-15］。Zhang等［12］顯示敲減表達(dá)可通過促進(jìn)p53表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。也有研究顯示在血管平滑肌細(xì)胞凋亡中SET8也起重要作用［16］。但SET8在大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡和自噬中的具體作用機(jī)制尚不明確，因此本研究以體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞為模型，通過敲減表達(dá)，觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡情況及自噬蛋白DRAM1和LC3-II等蛋白變化。本研究結(jié)果顯示敲減表達(dá)后，p53、DRAM1和LC3-II表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖能力降低，凋亡增多。提示敲減后，可通過上調(diào)p53、DRAM1、LC3-II和Bax表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

有研究顯示過表達(dá)能夠上調(diào)自噬蛋白LC3-II表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生自噬［17］。也有研究表明DRAM1能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡［18］。而Bax和Bcl-2是一對正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)因子，Bax起促進(jìn)凋亡作用，Bcl-2起抗凋亡作用［19］。因此，我們推測DRAM1可能通過調(diào)控Bax、Bcl-2和LC3，進(jìn)而誘導(dǎo)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡。本研究以體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞為模型，給予過表達(dá)，觀察大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡及自噬情況。結(jié)果顯示給予過表達(dá)后，自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)升高，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低，大鼠血管平滑肌細(xì)胞凋亡增多，增殖顯著減少。結(jié)果提示，DRAM1可通過上調(diào)自噬蛋白LC3-II和凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡。2006年Crighton等［6］提出，是下游調(diào)節(jié)自噬的重要基因。編碼238個(gè)氨基酸，是調(diào)控自噬和凋亡的溶酶體膜蛋白［20-21］。為驗(yàn)證SET8是否通過p53和DRAM1通路調(diào)控大鼠血管平滑肌細(xì)胞自噬和凋亡，給予抑制表達(dá)的同時(shí)抑制和表達(dá)，結(jié)果顯示與只抑制表達(dá)組相比，抑制同時(shí)抑制或表達(dá)后，Bax和LC3-II顯著降低，Bcl-2顯著升高。

綜上所述，SET8低表達(dá)可以促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，可能機(jī)制是通過調(diào)節(jié)p53/DRAM1表達(dá)，促進(jìn)自噬蛋白LC3-II和凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而引起大鼠血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生了自噬和凋亡。

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（責(zé)任編輯：盧萍，李淑媛）

Knockdown ofpromotes autophagy and apoptosis of rat vascular smooth muscle cells by up-regulating p53/DRAM1 signaling pathway

LIU Lan， ZHANG Dong-xue， ZHU Rong-fang， LI Hui， LIANG Xiang-nan， ZHANG Sheng-lei， BAI Ya-ling△

（，，050011，）

To investigate whether lysine methyltransferase SET domain-containing protein 8 （） knockdown regulates the autophagy and apoptosis of rat vascular smooth muscle cells （VSMCs） through p53/DNA damage-regulated autophagy modulator 1 （DRAM1） signaling pathway.Rat VSMCs were divided into 3 groups： normal group， vector group and SET8-shRNA group. Apoptosis was detected by flow cytometry， viability was detected by MTT， and the protein levels of SET8， p53， DRAM1， LC3， Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. VSMCs of rats were divided into 3 groups： normal group， vector group and DRAM1 overexpression group. Cell viability， apoptosis and protein levels of DRAM1， LC3， Bax and Bcl-2 were detected.The protein expressions of LC3， Bax and Bcl-2 were observed in VSMCs of rats following suppression oforwhile interfering with.The apoptosis of VSMCs was increased significantly and viability was decreased significantly afterknockdown（<0.05）. Western blot showed that the expressions of SET8 and Bcl-2 were decreased， and the expressions of p53， DRAM1， LC3-II and Bax were increased significantly afterknockdown（<0.05）. Apoptosis of VSMCs was increased significantly and viability was decreased significantly after overexpression of（<0.05）. Western blot showed that the expressions of DRAM1， LC3-II and Bax were increased and the expression of Bcl-2 was decreased after overexpression of DRAM1 （<0.05）. The expressions of LC3 and Bax were decreased and the expression of Bcl-2 was increased after inhibiting the expression ofor（<0.05）.Autophagy and apoptosis in vascular smooth muscle cells of rats were promoted by knockdown ofThe possible mechanism is to promote the expression of autophagy protein LC3-II and apoptotic protein Bax by upregulating the expressions of p53 and DRAM1.

Vascular smooth muscle cells； SET8； DRAM1； Autophagy； Apoptosis

R363.2； R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.006

1000-4718（2022）03-0427-07

2021-08-20

2022-01-04

［基金項(xiàng)目］河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（No. 20180513； No. 20190702）

Tel： 15081150811； E-mail： snbyl@163.com