廖劍雄， 羅杰， 劉琳， 張謙△， 劉維佳△

IL-6及GATA-6甲基化抑制劑在動脈型肺動脈高壓大鼠肺組織中的作用及意義*

廖劍雄1， 羅杰2， 劉琳3， 張謙1△， 劉維佳3△

（1貴州省人民醫(yī)院急診內科，貴州 貴陽 550002，2貴州大學醫(yī)學院，貴州 貴陽 550003，3貴州省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，貴州 貴陽 550002）

通過野百合堿（MCT）誘導的大鼠動脈型肺動脈高壓（PAH）模型研究給予白細胞介素6（IL-6）及GATA結合蛋白6（GATA-6）甲基化抑制劑后大鼠肺組織中IL-6、GATA-6及GATA-6甲基化的變化及意義。將40只成年雄性SD大鼠隨機分成對照組（按60 mg/kg單次腹腔內注射2∶8的無水乙醇生理鹽水混合液）、MCT組（1% MCT按60 mg/kg單次腹腔內注射）、MCT+二甲基亞砜（DMSO）組（等量1% MCT腹腔內注射后每周3次腹部皮下注射1 mg/kg DMSO）、MCT+IL-6抗體（anti-IL-6）組（等量1% MCT腹腔內注射后每天腹部皮下注射40 μg/kg anti-IL-6）和MCT+5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza）組（等量1% MCT腹腔內注射后每周3次皮下注射1 mg/kg 5-Aza），每組8只。于造模后第21天做右心室壓力監(jiān)測，計算右心室肥厚指數，肺組織HE染色觀察肺病理改變，免疫熒光及Western blot檢測肺組織中IL-6和GATA-6的表達，甲基化特異性PCR（MSP）檢測肺組織中GATA-6甲基化程度。與對照組比較，MCT組、MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組右心室平均壓力顯著升高（<0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組右心室平均壓力顯著降低（<0.05）。與對照組比較，MCT組右心室肥厚指數顯著增高（<0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組右心室肥厚指數顯著減低（<0.05）。IL-6免疫熒光及Western blot結果顯示，與對照組比較，MCT組和MCT+5-Aza組IL-6表達顯著增多（<0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組IL-6表達顯著減少（<0.05）。GATA-6免疫熒光及Western blot結果顯示，與對照組比較，MCT組和MCT+5-Aza組GATA-6表達顯著減少（<0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組GATA-6表達顯著增多（<0.05）。MSP結果顯示，對照組肺組織中GATA-6未發(fā)生明顯甲基化；MCT組及MCT+DMSO組GATA-6呈高度甲基化；MCT+anti-IL-6組及MCT+5-Aza組GATA-6呈低度甲基化。在PAH大鼠肺組織中給予anti-IL-6后IL-6的表達顯著減少，給予5-Aza后GATA-6的表達顯著增多，而GATA-6甲基化程度顯著降低。IL-6的高表達可能是導致GATA-6低表達的原因，其機制可能是IL-6誘導了GATA-6的甲基化。

動脈型肺動脈高壓；白細胞介素6；GATA結合蛋白6；5-氮雜-2'-脫氧胞苷

動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一種進行性加重而不可治愈的慢性肺部疾病，因其導致患者的生活質量差、住院率及死亡率高而成為近年來研究的熱點［1］。PAH的發(fā)病機制較為復雜，現有研究顯示炎癥反應及肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cell， PASMC）異常增殖為主要發(fā)病機制［2-3］。之前我們在PAH動物模型的研究已經證實白細胞介素6（interleukin-6， IL-6）及GATA結合蛋白6（GATA-binding protein-6， GATA-6）在上述發(fā)病機制中可能起到作用，同時發(fā)現肺組織中IL-6與GATA-6表達呈顯著負相關，而GTAT-6持續(xù)低表達可能與GATA-6甲基化有關［4-5］。

DNA甲基化是表觀遺傳學的一種化學修飾形式，會導致靶基因沉默而抑制其表達，這個過程中DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferases， DNMTs）作為關鍵酶起到決定性作用［6］。5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine， 5-Aza）是一種被FDA批準DNMTs抑制劑，它通過催化DNMT1去甲基化依賴蛋白酶體的形成來降解DNMT1，從而實現靶基因的去甲基化，臨床常用于治療骨髓增生異常綜合征［7］。為此本研究以野百合堿（monocrotaline， MCT）誘發(fā)大鼠PAH模型，并以5-Aza和IL-6抗體（anti-IL-6）為抑制劑，通過檢測大鼠肺組織中IL-6和GATA-6表達及GATA-6甲基化程度，探討三者在PAH發(fā)展中的作用及關系。

材料和方法

1　實驗動物和主要試劑

健康成年清潔級雄性SD大鼠40只，體重250～300 g，第三軍醫(yī)大學動物實驗室提供并飼養(yǎng)，本研究已通過貴州省人民醫(yī)院倫理委員會審核（編號：2018-001），所有操作均遵守實驗動物倫理規(guī)范。大鼠籠盒飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度25 ℃，濕度60%～70%，自由進食、飲水。所有動物實驗均在貴州醫(yī)科大學動物實驗中心進行，許可證號：SYXK（黔）2018-0001。

MCT（Lot#41616）和5-Aza（Lot#29075）均購于MCE；IL-6 Ⅰ抗（GR3190303-16）和GATA-6 Ⅰ抗（GR297606-4）均購于Abcam；山羊抗兔Ⅱ抗（ZF-0316）購于北京中杉金橋生物有限公司；一步法快速WB（HRP）試劑盒（兔，20330；鼠，30324）均購于康為世紀公司；PageRuler? Plus Prestained Protein Ladder（00459134）購于Thermo；Methylation-Gold Kit［D5005S（10）］購于ZYMO；DNA提取試劑盒（DP304）購于天根生化科技（北京）有限公司。

2　方法

2.1實驗動物分組、模型建立及檢測時點確認大鼠自由飼養(yǎng)1周后于造模前1 d用混合溶劑（無水乙醇∶生理鹽水=2∶8）將MCT溶解、稀釋，配成1% MCT溶液37 ℃過夜；造模當天用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）將5-Aza溶解、稀釋，配成1 g/L的5-Aza溶液。采用隨機數字表法將大鼠分成5組，即對照組（于造模當天按60 mg/kg單次腹腔內注射2∶8的無水乙醇生理鹽水混合液）、MCT組（于造模當天1% MCT按60 mg/kg單次腹腔內注射）、MCT+DMSO組（于造模當天等量1% MCT腹腔內注射后每周3次腹部皮下注射1 mg/kg DMSO，持續(xù)3周）、MCT+anti-IL-6組（于造模當天等量1% MCT腹腔內注射后每天腹部皮下注射40 μg/kg anti-IL-6，持續(xù)3周）和MCT+5-Aza組（于造模當天等量1% MCT腹腔內注射后每周3次皮下注射1 mg/kg 5-Aza，持續(xù)3周），每組8只。記造模當天為第1天，于第21天［8］將大鼠做檢測。

2.2右心導管法測右心室壓力于第21天分別取各組大鼠8只，手術前禁食8 h，10%水合氯醛（0.04 mL/kg）腹腔注射麻醉，將PE10管預充肝素鹽水采用右心導管法經右側頸外靜脈插管至右心室，用BL-420S生物信號采集分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司生產）檢測右心室壓力，并計算右心室平均壓力。

2.4稱重法計算右心室肥厚指數各組大鼠測完右心室壓力后均斷頭處死開胸后完整取出心臟，剪去左右心房及心耳，在肺動脈出口處剪開右心室游離壁組織（RV），其余則為左心室（LV）+室間隔組織（S），洗去血污，吸干水分，然后分別稱重，按公式［右心肥厚指數=RV/（LV+S）］計算。

2.5肺組織HE染色病理學檢測檢測右心室壓力后，取肺組織用生理鹽水通過肺動脈沖洗剩余的血液，分離右側第三葉肺組織放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色、封片。在數碼三目攝像顯微鏡（BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）下對切片進行圖像采集及分析。

2.6免疫熒光法檢測肺組織IL-6和GATA-6表達檢測右心室壓力后，生理鹽水沖洗干凈肺組織，取右側第三葉肺組織放入4%多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復后進行如下操作：滴加新生牛血清封閉液室溫孵育30 min；分別滴加GATA-6 Ⅰ抗（1∶200）和IL-6 Ⅰ抗（1∶100）4 ℃過夜；滴加羅丹明標記的Ⅱ抗（山羊抗兔原液），37 ℃孵育30 min；滴加DAPI復染，室溫孵育10 min；抗熒光衰減封片劑封片和鏡檢；采用熒光掃描顯微鏡攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集；應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)將綠色/紅色熒光單色照片轉換為黑白圖片然后選取相同的黑色作為判斷陽性的統(tǒng)一標準，計算累積光密度和面積，并求出面密度，使用3張圖像的平均面密度再計算平均數，得出每例樣本的平均面密度。

2.7Western blot檢測肺組織IL-6和GATA-6蛋白表達稱取適量肺組織，RIPA裂解液與PMSF體積比按99∶1混勻，充分裂解組織，冰上孵育20 min后，10 000 r/min離心20 min，收集上清。根據BCA蛋白試劑盒測蛋白濃度，垂直電泳后，轉膜2 h，封閉20 min，IL-6和GATA-6 Ⅰ抗（1∶1 000）4 ℃過夜，HRP鼠IL-6 Ⅱ抗和HRP兔GATA-6 Ⅱ抗（1∶200）室溫孵育2 h，IL-6的內參照為β-actin（1∶200），GATA-6的內參照為histone H3（1∶200），ECL發(fā)光液化學發(fā)光，膠片曝光。采用Gel-Pro Analyzer 4圖像分析軟件測定各條帶的灰度值并定量分析。

2.8甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR， MSP）法檢測肺組織GATA-6甲基化程度將肺組織處理為細胞懸液，按組織基因組DNA提取試劑盒說明步驟提取基因組DNA，根據Methylation-Gold Kit試劑合步驟對基因組DNA進行重亞硫酸鹽修飾。設置反應體系為：10× PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 μmol/L引物2.0 μL，基因組DNA 3.0 μL，5 U/μL Taq HS 0.1 μL，ddH2O 14.9 μL。設置反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)；最后72 ℃末段延伸5 min。所有引物均交由武漢金開瑞生物工程有限公司設計合成（表1）。結果經2%瓊脂凝膠電泳顯像，并觀察條帶情況，照相記錄。

表1　甲基化特異性PCR的引物序列

M： methylated； U： unmethylated.

3　統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析，多重比較均采用LSD法。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　各組大鼠右心室平均壓力變化

與對照組比較，MCT、MCT+anti-IL-6和MCT+5-Aza組右心室平均壓力顯著升高（<0.05）；MCT+DMSO組與MCT組比較無顯著差異（>0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6和MCT+5-Aza組右心室平均壓力顯著降低（<0.05），見圖1。

Figure 1.Comparison of mean right ventricular pressure in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group. Mean±SD. n=8. #P<0.05 vs A； *P<0.05 vs B.

2　各組大鼠右心室肥厚指數變化

與對照組比較，MCT組右心室肥厚指數顯著增高（<0.05），MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組未見顯著差異（>0.05）；MCT+DMSO組與MCT組比較無顯著差異（>0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組右心室肥厚指數顯著減低（<0.05），見圖2。

Figure 2.Comparison of right ventricular hypertrophy index in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group. Mean±SD. n=8. #P<0.05 vs A； *P<0.05 vs B.

3　各組大鼠肺組織HE染色光鏡下病理改變

對照組各級動脈壁結構清晰，厚度正常，血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤，肺泡內無明顯巨噬細胞浸潤；MCT組血管周圍炎癥細胞呈環(huán)狀浸潤，形成血管袖套（黑色箭頭），平滑肌增生肥厚，管壁肌型化（紅色箭頭），組織小范圍可見肺泡性水腫，大量肺泡內充滿嗜酸性蛋白樣物質（綠色箭頭），并伴較多炎性細胞滲出（黃色箭頭）；MCT+DMSO組血管周圍炎癥細胞呈環(huán)狀浸潤，血管壁結構疏松，層次不清（紅色箭頭），組織可見肺泡性水腫，大量肺泡內充滿嗜酸性蛋白樣物質（綠色箭頭），并伴較多炎癥細胞滲出（黃色箭頭）；MCT+anti-IL-6組動脈管壁結構清晰，血管周圍無炎癥細胞浸潤，少量動脈壁明顯增厚，平滑肌增生肥厚，管壁肌型化（黑色箭頭），管壁周圍間隙增寬，伴蛋白樣液滲出（紅色箭頭），少量肺泡內可見泡沫狀巨噬細胞（黃色箭頭）；MCT+5-Aza組大量血管周圍炎癥細胞呈環(huán)狀浸潤，形成血管袖套（黑色箭頭），局部肺泡內較多泡沫狀巨噬細胞聚集（黃色箭頭），見圖3。

Figure 3.staining of Lung tissue in the mice of each group （HE staining， ×400）. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group.

4　各組大鼠肺組織IL-6表達

Western blot和免疫熒光結果均顯示，與對照組比較，MCT組和MCT+5-Aza組IL-6的表達顯著增高（<0.05），MCT+anti-IL-6組無顯著差異（>0.05）；MCT+DMSO組與MCT組比較無顯著差異（>0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組IL-6的表達顯著減低（<0.05），見圖4、5。

Figure 4.Western blot detection of IL-6 protein in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group. Mean±SD. n=8. #P<0.05 vs A； *P<0.05 vs B.

Figure 5.Immunofluorescence of IL-6 protein in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group.

5　各組大鼠肺組織GATA-6表達的免疫熒光結果

Western blot和免疫熒光結果均顯示，與對照組比較，MCT組和MCT+5-Aza組GATA-6的表達顯著減低（<0.05），MCT+anti-IL-6組無顯著差異（>0.05）；MCT+DMSO組與MCT組比較無顯著差異（>0.05）；與MCT組比較，MCT+anti-IL-6組和MCT+5-Aza組GATA-6的表達顯著增高（<0.05），見圖6、7。

Figure 6.Western blot detection of GATA-6 protein in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group. Mean±SD. n=8. #P<0.05 vs A； *P<0.05 vs B.

Figure 7.Immunofluorescence comparison GATA-6 of protein in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group. Mean±SD. n=8. #P<0.05 vs A； *P<0.05 vs B.

6　各組大鼠肺組織GATA-6甲基化結果

對照組大鼠肺組織中GATA-6未發(fā)生明顯甲基化；MCT組及MCT+DMSO組大鼠肺組織中GATA-6呈高度甲基化；MCT+anti-IL-6組及MCT+5-Aza組肺組織中GATA-6呈低甲基化，與MCT組比較甲基化程度明顯減弱，見圖8。

Figure 8.GATA-6 MSP electrophoretogram in the mice of each group. A： control group； B： MCT group； C： MCT+DMSO group； D： MCT+anti-IL-6 group； E： MCT+5-Aza group； M： methylated； U： unmethylated.

討論

IL-6作為PAH發(fā)病過程中最重要的因子之一已被國內外大多學者認可，一方面IL-6通過激活信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）在Y705位點的磷酸化，導致細胞內DNA結合、二聚體形成、核易位來增強細胞收縮能力，延長細胞存活，從而促進PASMC增殖［9］；另一方面IL-6可以干預骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）信號通路中BMP9的活性使得內皮細胞表型異常轉化，從而導致內皮-間質轉化（EndMT）過程中EndMT信號延長，其結果是細胞內促炎癥反應信號持續(xù)加強（如TGF-β1、p-Smad2/3等）、細胞缺氧加重及凋亡加速，最終導致PASMC異常增殖［10-11］。一份來自美國國立衛(wèi)生研究院肺動脈高壓生物庫（PAHB）和科羅拉多州兒童醫(yī)院（CHC）共236位PAH患者的血清隊列研究顯示IL-6與患者的死亡率、肺移植的成功率、姑息性手術時機顯著相關，此后該研究還通過對患者平均肺動脈壓力、肺動脈楔壓、右心室輸出功率、左心輸出量等血流動力學指標進行分析推測IL-6作為PAH的早期標記物能更早的預警PAH導致的心力衰竭，其敏感性甚至高于N末端B型利鈉肽前體（NT-proBNP）［12-13］。同時Hernández-Sánchez等［14］的臨床研究顯示給予IL-6受體抑制劑后能有效降低肺動脈壓力并改善PAH患者的生活質量，提示IL-6也是目前治療PAH潛在研究靶點。我們的研究結果顯示在PAH模型建立成功后MCT組肺組織HE染色有大量炎癥細胞及肺水腫表現，且肺組織中IL-6的Western blot及免疫熒光結果顯示與對照組比較顯著增高，再次證實IL-6在PAH形成中發(fā)揮著重要作用，同時我們給予MCT+anti-IL-6組大鼠IL-6抑制劑后發(fā)現MCT+anti-IL-6組大鼠右心室平均壓力、右心室肥厚指數、肺組織中IL-6的Western blot及免疫熒光表達較MCT組均顯著降低，HE染色也顯示給予IL-6抑制劑后肺組織炎癥反應及肺水腫均明顯好轉，其結果與上述文獻報道一致，也提示IL-6在PAH的發(fā)展中所涉及的機制可能是成為治療PAH潛在靶點。

研究證實GATA-6作為鋅指結構轉錄因子其高表達可以維持正常血管平滑肌細胞的穩(wěn)定，但低表達則促進了VSMC的損傷，機制可能為損傷導致了GATA-6 的沉默，而GATA-6的沉默可通過內皮細胞-GATA-6-PDGF（血小板衍生的生長因子）-B通路誘導VSMC表型轉換的失調來實現VSMC的損傷，所以推測GATA-6可能是發(fā)生VSMC異常增殖的主要靶點［15］。最新報道顯示BMPR2突變可以引起PASMC增殖異常［16］，但抑制人類直系同源物（TWIST1）則可逆轉這一現象，主要原因為TWIST1的抑制可以促進GATA-6合成所依賴的結合蛋白釋放，而GATA-6的大量合成則直接導致了BMPR2的表達受限（GATA-6被證實為BMPR2啟動子區(qū)下游靶點）從而抑制了PASMC的異常增殖［17］。從Lentjes等［18］的綜述中我們發(fā)現GATA-6作為胚體內胚層的代表基因可以促進心血管上皮細胞的分化及發(fā)育，并且能防止該類細胞的過分化，此后一項胚胎干細胞的研究顯示GATA-6的沉默主要是GATA-6啟動子區(qū)發(fā)生了甲基化的結果，而5-Aza作為去甲基化劑可以逆轉GATA-6的沉默，恢復GATA-6的功能［19］。我們的研究在PAH模型建立成功后MCT組大鼠肺組織中Western blot及免疫熒光結果顯示GATA-6表達較對照組均顯著降低，而GATA-6的MSP結果提示對照組大鼠并未出現明顯甲基化，而MCT組大鼠出現了高度的甲基化，提示PAH發(fā)生過程中GATA-6的低表達可能是因為GATA-6甲基化所致，在此基礎上我們給予5-Aza處理MCT+5-Aza組大鼠發(fā)現該組大鼠右心室平均壓力及右心室肥厚指數較MCT組顯著降低，再次對MCT+5-Aza組肺組織進行Western Blot及免疫熒光檢測發(fā)現GATA-6的表達較MCT組顯著增高，MCT+5-Aza組GATA-6的MSP結果也顯示甲基化程度較MCT組顯著減弱，而且MCT+5-Aza組HE染色結果顯示肺組織中炎癥反應及肺水腫情況與MCT組比較明顯改善，提示大鼠PAH有大幅度好轉，與上述文獻報道結果相似，再次證實GATA-6在PAH的發(fā)展中可能起到不可忽略的作用。

最后我們在PAH模型建立成功后給予IL-6抑制劑處理MCT+anti-IL-6組大鼠發(fā)現，與MCT組比較MCT+anti-IL-6組大鼠右心室平均壓力及右心室肥厚指數顯著降低（Western Blot及免疫熒光結果顯示肺組織中IL-6的表達顯著減低，而GATA-6的表達顯著增加，HE染色結果也顯示MCT+anti-IL-6組大鼠肺組織炎癥反應與肺水腫較MCT組大幅度好轉，同時GATA-6的MSP結果顯示MCT+anti-IL-6組大鼠GATA-6呈低甲基化，再將MCT+anti-IL-6組大鼠右心室肥厚指數、肺組織中IL-6及GATA-6的表達與對照組比較甚至發(fā)現無統(tǒng)計學意義，而這些結果與MCT組大鼠肺組織檢測結果恰恰相反。查閱相關文獻我們發(fā)現關于IL-6誘導靶基因甲基化導致靶基因沉默的研究屢見不鮮，例如：（1）在腸預激綜合征（IBS）的研究中發(fā)現IL-6增加了組蛋白H3賴氨酸9（H3K9）的甲基化，使得腸上皮細胞緊密連接蛋白（TJ）表達下調，導致細胞通透性增加而產生內臟痛覺過敏［20］：（2）膿毒癥的相關研究顯示對單核細胞中與膿毒癥發(fā)病相關的全基因組進行甲基化分析發(fā)現隨著IL-6水平的增加出現了2492個CpG位點高甲基化及909個CpG位點低甲基化［21］；（3）在骨骼肌疾病的研究中發(fā)現IL-6通過增加DNMT的表達間接性的導致微小RNA142-3p（miR142-3p）啟動子的高度甲基化，從而促進膠質母細胞瘤的生長［22］。所以結合本次研究結果，我們有理由懷疑PAH的形成中GATA-6的高度甲基化可能是高表達的IL-6誘導的，而該機制可能在PAH的發(fā)展過程中起到作用。

綜上所述，在PAH大鼠肺組織中給予IL-6抗體后IL-6的表達顯著減低，給予5-Aza后GATA-6的表達顯著增高，而GATA-6甲基化程度顯著減低；同時IL-6的高表達可能是導致GATA-6低表達的原因，其機制可能為IL-6誘導了GATA-6的甲基化，而該機制是否在PAH的發(fā)展中起到作用有望本研究的體內實驗進一步明確。

［1］ Gonzalez-Garcia MC， Fatehi F， Varnfield M， et al. Use of eHealth in the management of pulmonary arterial hypertension： review of the literature［J］. BMJ Health Care Inform， 2020， 27（3）：e100176.

［2］ Li TZ， Li SQ， Feng YL， et al. Combination of dichloroacetate and atorvastatin regulates excessive proliferation and oxidative stress in pulmonary arterial hypertension development via p38 signaling［J］. Oxid Med Cell Longev， 2020， 2020：6973636.

［3］張婷， 蔡海鑒， 楊林， 等. 積雪草苷通過抑制NF-κB/p38通路減輕小鼠低氧性肺動脈高壓［J］. 中國病理生理雜志， 2019， 35（9）：1600-1607.

Zhang T， Cai HJ， Yang L， et al. Asiaticoside attenuates hypoxic pulmonary hypertension in mice by inhibiting NF-κB/p38 signaling pathway［J］. Chin J Pathophysiol， 2019， 35（9）：1600-1607.

［4］廖劍雄. 肺動脈高壓大鼠肺組織中IL-6、GATA-6表達水平及GATA-6甲基化程度的意義［D］. 遵義： 遵義醫(yī)科大學， 2020.

Liao JX. The significance of IL-6， GATA-6 and GATA-6 methylation in pulmonary tissues of rats with pulmonary arterial hypertension［D］. Zunyi： Zunyi Medical University， 2020.

［5］廖劍雄， 張一馳， 王炳今， 等. IL-6與GATA-6在肺動脈高壓大鼠肺組織中的表達及意義［J］. 遵義醫(yī)科大學學報， 2019， 42（5）：534-538.

Liao JX， Zhang YC， Wang BJ， et al. Expression and significance of IL-6 and GATA-6 in pulmonary hypertension rats［J］. J Zunyi Med Univ， 2019， 42（5）：534-538.

［6］ Dahlet T， Argüeso LA， Ai AH， et al. Genome-wide analysis in the mouse embryo reveals the importance of DNA methylation for transcription integrity［J］. Nat Commun， 2020， 11：3153.

［7］ Chen JY， Wu LX， Xu H， et al. 5-Aza-CdR regulates RASSF1A by inhibiting DNMT1 to affect colon cancer cell proliferation， migration and apoptosis［J］. Cancer Manag Res， 2019， 11：9517-9528.

［8］ Guihaire J， Bogaard HJ， Flécher E， et al. Experimental models of right heart failure： a window for translational research in pulmonary hypertension［J］. Semin Respir Crit Care Med， 2013， 34（5）：689-699．

［9］ Kurahara LH， Hiraishi K， Yamamura A， et al. Eicosapentaenoic acid ameliorates pulmonary hypertension via inhibition of tyrosine kinase Fyn［J］. J Mol Cell Cardiol， 2020， 148：50-62.

［10］ 張靜靜， 王崗， 李滿祥， 等. 內皮-間充質轉化在肺動脈高壓發(fā)病機制中的研究進展［J］. 中國病理生理雜志， 2018， 34（9）：1724-1728.

Zhang JJ， Wang L， Li MX， et al. Pathogenesis of endothelial-mesenchymal transition in pulmonary arterial hypertension［J］. Chin J Pathophysiol， 2018， 34（9）：1724-1728.

［11］ 張聰聰， 張晶晶， 武垣伶， 等. TGF-β/Smads通路參與EndoMT在HHPH中的作用及益氣溫陽活血化痰方的干預效應［J］. 中國病理生理雜志， 2018， 34（3）：507-514.

Zhang CC， Zhang JJ， Wu HL， et al. Role of EndoMT in HHPH based on TGF-β/Smads signaling pathway and regulated by Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula［J］. Chin J Pathophysiol， 2018， 34（3）：507-514.

［12］ Chen JY， Griffiths M，Yang J， et al. Elevated interleukin-6 levels predict clinical worsening in pediatric pulmonary arterial hypertension［J］. J Pediatr， 2020， 223：164-169.e1.

［13］ Simpson CE， Chen JY， Damico RL， et al. Cellular sources of interleukin-6 and associations with clinical phenotypes and outcomes in pulmonary arterial hypertension［J］. Eur Respir J， 2020， 55（4）：1971061.

［14］ Hernández-Sánchez J， Harlow L， Church C， et al. Clinical trial protocol for TRANSFORM-UK： a therapeutic open-label study of tocilizumab in the treatment of pulmonary arterial hypertension［J］. Pulm Circ， 2018， 8（1）：2045893217735820.

［15］ Zhuang T， Liu J， Chen XL， et al. Cell-specific effects of GATA （GATA zinc finger transcription factor family）-6 in vascular smooth muscle and endothelial cells on vascular injury neointimal formation［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2019， 39（5）：888-901.

［16］ Happé C， Kurakula K， Sun XQ， et al. The BMP receptor 2 in pulmonary arterial hypertension： when and where the animal model matches the patient［J］. Cells， 2020， 9（6）：1422.

［17］ Fan Y， Gu X， Zhang J， et al. TWIST1 drives smooth muscle cell proliferation in pulmonary hypertension via loss of GATA-6 and BMPR2［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2020， 202（9）：1283-1296.

［18］ Lentjes MH， Niessen HEC， Akiyama Y， et al. The emerging role of GATA transcription factors in development and disease［J］. Expert Rev Mol Med， 2016， 18：e3.

［19］ Diomede F， Zini N， Pizzicannella J， et al. 5-Aza exposure improves reprogramming process through embryoid body formation in human gingival stem cells［J］. Front Genet， 2018， 9：419.

［20］ Wiley JW， Zong Y， Zheng G， et al. Histone H3K9 methylation regulates chronic stress and IL-6-induced colon epithelial permeability and visceral pain［J］. Neurogastroenterol Motil， 2020， 32（12）：e13941.

［21］ Lorente-Sorolla C， Garcia-Gomez A， Català-Moll F， et al. Inflammatory cytokines and organ dysfunction associate with the aberrant DNA methylome of monocytes in sepsis［J］. Genome Med， 2019， 11：66.

［22］ Moresi V， Adamo S， Berghella L. The JAK/STAT pathway in skeletal muscle pathophysiology［J］. Front Physiol， 2019， 10：500.

（責任編輯：盧萍，羅森）

Role and significance of IL-6 and GATA-6 methylation inhibitors in lung tissue of rats with pulmonary arterial hypertension

LIAO Jian-xiong1， LUO Jie2， LIU Lin3， ZHANG Qian1△， LIU Wei-jia3△

（1，，550002，；2，，550003，；3，，550002，）

To study the changes and significance of interleukin-6 （IL-6）， GATA-binding protein-6 （GATA-6） and GATA-6 methylation in monocrotaline （MCT）-induced rat pulmonary arterial hypertension （PAH） model.Forty adult male SD rats were randomly divided into control group， MCT group， MCT+dimethyl sulfoxide （DMSO） group， MCT+IL-6 antibody （anti-IL-6） group and MCT+5-aza-2'-deoxycytidine （5-Aza） group， with 8 rats in each group. The rats in control group

a single intraperitoneal injection of 2∶8 anhydrous ethanol and physiological saline mixture at 60 mg/kg. The rats in MCT group received a single intraperitoneal injection of 1% MCT at 60 mg/kg. The rats in MCT+DMSO group were intraperitoneally injected with the same amount of 1% MCT and subcutaneously injected DMSO at 1 mg/kg into the abdomen 3 times a week. The rats in MCT+anti-IL-6 group were intraperitoneally injected with the same amount of 1% MCT and then intraperitoneally injected with anti-IL-6 at 40 μg/kg every day. The rats in MCT+5-Aza group were intraperitoneally injected with the same amount of 1% MCT and then injected subcutaneously with 5-Aza at 1 mg/kg 3 times a week. On the 21st day after modeling， the rats in each group were monitored for right ventricular pressure and right ventricular hypertrophy index. Lung tissue HE staining was performed to observe lung pathological changes. The IL-6 and GATA-6 expression in lung tissues was detected by immunofluorescence and Western blot. The GATA-6 methylation in lung tissues was detected by methylation-specific PCR （MSP）.Compared with control group， the average right ventricular pressure in MCT， MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups was significantly increased （<0.05）. Compared with MCT group， the average pressure of right ventricle in MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups was significantly decreased （<0.05）. Compared with control group， the right ventricular hypertrophy index in MCT group was significantly increased （<0.05）. Compared with MCT group， the right ventricular hypertrophy index in MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups was significantly decreased （<0.05）. Immunofluorescence and Western blot results showed that the expression of IL-6 in MCT and MCT+5-Aza groups was significantly increased compared with control group （<0.05）， while that in MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups was significantly reduced compared with MCT group （<0.05）. The expression of GATA-6 in MCT and MCT+5-Aza groups was significantly reduced compared with control group （<0.05）， while that in MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups was significantly increased compared with MCT group （<0.05）. The MSP results showed that GATA-6 in lung tissues was highly methylated in MCT and MCT+DMSO groups， hypomethylated in MCT+anti-IL-6 and MCT+5-Aza groups， and unmethylated in control group.In the lung tissue of rats with PAH， the IL-6 expression is significantly reduced after anti-IL-6 treatment， the GATA-6 expression is significantly increased after 5-Aza treatment， and the degree of GATA-6 methylation is significantly reduced. The high expression of IL-6 may be a result of low GATA-6 expression， which is caused by GATA-6 methylation.

Pulmonary arterial hypertension； Interleukin-6； GATA-binding protein-6； 5-Aza-2'-deoxycytidine

R543.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.017

1000-4718（2022）03-0517-09

2021-08-26

2021-12-24

［基金項目］貴州省科技計劃項目（黔科合基礎［2018］1408號）

劉維佳 Tel： 18984383552； E-mail： weijia902@126.com； 張謙 Tel： 18985008119； E-mail： zhangqian800@126.com