王凱， 宋敏，2△， 宋志靖，2， 李金益， 范凱， 海云翔

活血定眩膠囊含藥血清對氧糖剝奪誘導的bEnd.3細胞鐵死亡的影響*

王凱1， 宋敏1，2△， 宋志靖1，2， 李金益1， 范凱1， 海云翔1

（1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 730000；2甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020）

探討活血定眩膠囊（HXDX）對氧糖剝奪（OGD）誘導小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3鐵死亡的影響。將bEnd.3細胞分為空白對照（control）組、OGD組、OGD+鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）組及OGD+HXDX組，control組細胞正常培養(yǎng)，其他組建立OGD模型，OGD+Fer-1組和OGD+HXDX組分別加入1 μmol/L Fer-1和10% HXDX含藥血清后OGD處理6 h。FerroOrange探針測定細胞內Fe2+水平，DCFH-DA探針檢測活性氧（ROS）含量，試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平，Western blot檢測核因子E2相關因子2（Nrf2）、鐵蛋白重鏈1（FTH1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）、環(huán)加氧酶2（COX2）和NADPH氧化酶1（NOX1）蛋白表達。與control組比較，OGD組bEnd.3細胞內Fe2+熒光強度與ROS含量顯著增加；SOD活性降低，GSH表達下降，MDA含量顯著增高（<0.05）；FTH1和GPX4表達降低，ACSL4、COX2和NOX1表達升高（<0.05），Nrf2無顯著差異。HXDX含藥血清處理后，Fe2+水平和ROS含量顯著降低（<0.05）；SOD活性和GSH含量顯著升高，MDA水平顯著降低（<0.05）；Nrf2、FTH1與GPX4蛋白的表達顯著增高（<0.05），COX2和NOX1蛋白表達降低（<0.05），ACSL4無顯著差異。活血定眩膠囊可抑制體外OGD誘導的bEnd.3細胞鐵死亡，其機制與降低細胞內Fe2+和ROS含量、減輕脂質過氧化及調控鐵死亡相關蛋白表達有關。

椎動脈型頸椎??；活血定眩膠囊；bEnd.3細胞；氧糖剝奪；鐵死亡

椎動脈型頸椎?。╟ervical spondylosis of vertebral artery type， CSA）是以眩暈、頭痛為主要臨床表現，伴有頸部僵滯不適、惡心、嘔吐、汗出異常等癥狀的綜合征，是頸椎病中病理機制較為復雜的一類分型［1］。近些年，CSA的發(fā)病率逐年上升，高達17.3%，且呈現出低齡化趨勢，嚴重危害患者身心健康［2］。中醫(yī)藥在CSA的防治中療效確切、安全性高，彰顯出了良好的應用前景。

鐵死亡是一種新型的細胞死亡類型，以鐵代謝紊亂、活性氧（reactive oxygen species，ROS）聚集及脂質過氧化為特征性改變［3］，對缺血性腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有著重要的影響，抑制鐵死亡能夠明顯減輕腦組織和神經元的缺血損害［4］。

bEnd.3細胞是一種人工培育的、具有腦微血管內皮細胞特性的細胞株，目前多采用氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation， OGD）處理建立缺血缺氧損傷模型［5］。在CSA發(fā)病過程中，椎動脈缺血導致血管內皮細胞氧化應激損傷，代謝產物過度積累，會進一步加重腦部的供血不足。

活血定眩膠囊（Huoxue-Dingxuan capsule， HXDX）由黃芪、當歸、丹參、白芷、葛根、赤芍、石決明、天麻、鉤藤、刺蒺藜、桑寄生和甘草共12味中藥組成，具有補氣活血、定眩通絡之效。前期研究表明，HXDX具有清除氧自由基、降低脂質過氧化、對抗bEnd.3細胞缺氧損傷、抑制細胞凋亡的作用［6］；還能通過對bEnd.3細胞自噬的雙向調節(jié)，減輕缺血缺氧引起的血管內皮細胞損傷，以維持血管微環(huán)境的穩(wěn)定［7］。但HXDX能否通過調節(jié)鐵死亡而減輕血管內皮細胞的氧化應激損傷，既往鮮有報道?；诖?，本項工作建立血管內皮細胞的OGD損傷模型，觀察bEnd.3細胞鐵死亡的情況，揭示HXDX對OGD誘導bEnd.3細胞鐵死亡的干預機制，以期為HXDX防治CSA的進一步研究提供參考資料。

材料和方法

1　實驗動物與細胞

6周齡SPF級Witar雄性大鼠30只，體重200～220 g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，條件為溫度 23～25℃，相對濕度（50±10）%。小鼠腦微血管內皮細胞株bEnd.3購自廣州集拓科技生物有限公司。

2　實驗試劑與設備

HXDX（甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥物制劑中心）；CCK8檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；ROS、丙二醛（malondialdehyde， MDA）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1； APExBIO）；FerroOrange亞鐵離子熒光探針（上海懋康生物科技有限公司）；抗鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1， FTH1）、NADPH氧化酶1（NADPH oxidase 1， NOX1）和長鏈脂酰輔酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthase 4， ACSL4）抗體（Abcam）；環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase 2， COX2）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）和核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。三氣培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；熒光顯微鏡（Olympus）；轉印電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；連續(xù)波長酶標儀、電泳儀電源和凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD）。

3　主要方法

3.1HXDX含藥血清的制備將Witar大鼠隨機分為空白組和含藥血清組，每組15只。含藥血清組按0.54 g/kg等效劑量的HXDX溶液灌胃，空白組給予同體積的生理鹽水，每天2次，連續(xù)1周。末次灌胃2 h后麻醉大鼠，“三線定位法”心臟取血［8］，1 917×離心15 min，移液器吸取上清液，56 ℃恒溫水浴滅活30 min，0.2 μm微孔濾膜除菌，-20 ℃條件儲存?zhèn)溆谩?/p>

3.2bEnd.3細胞的體外培養(yǎng)及分組處理復蘇原代bEnd.3細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、95%空氣及飽和濕度，待生長密度達到80%～90%時進行傳代。根據前期研究基礎，OGD條件下培養(yǎng)6 h后bEnd.3細胞的活細胞占比大于50%，比較符合后續(xù)實驗的要求，且10% HXDX含藥血清的干預作用最為明顯［9］。因此，將bEnd.3細胞分為空白對照（control）組、OGD組、OGD+Fer-1組和OGD+HXDX組。control組正常條件下培養(yǎng)；OGD組在低氧預處理的無糖培養(yǎng)液中加入10%空白血清，三氣培養(yǎng)箱中OGD誘導6 h，條件為37℃、5% CO2、94% N2、1% O2及飽和濕度；OGD+Fer-1組在OGD組基礎上加入1 μmol/L Fer-1；OGD+HXDX組將OGD組中的空白血清替換為10% HXDX含藥血清，OGD處理6 h。

3.3FerroOrange探針測定細胞內Fe2+含量將bEnd.3細胞以2×108/L的密度接種至6孔板，每孔加入2 mL細胞懸液，放置正常培養(yǎng)箱中過夜，按照3.2中方法進行操作；處理好的細胞棄去舊培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液清洗3遍后加入1 μmol/L FerroOrange染色液，CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。Hoechst 33342染色，室溫孵育5 min，生物型熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

3.4細胞內ROS含量檢測細胞分組及處理方法同3.2，干預6 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集各組細胞，352×離心5 min，去上清，加PBS重懸，將細胞潤洗2次，352×再離心5 min。按照DCFH-DA熒光探針法ROS試劑盒說明上機檢測。

3.5SOD、MDA和GSH水平的測定細胞處理按照3.2中的方法，用低溫PBS液清洗貼壁細胞，胰蛋白酶消化后157×離心5min，收集各組細胞，并通過反復凍融使細胞破碎，將提取液1 409×離心10 min，取上清液按照試劑盒操作說明檢測SOD活性及MDA和GSH含量。

3.6Western blot法檢測鐵死亡相關蛋白表達水平收集干預處理后的各組細胞，加入1 mL RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，將細胞碎片和裂解液移至離心管中，于4 ℃、12 000×離心5 min，吸取上清液進行蛋白濃度測定。將提取的蛋白與5ⅹ蛋白上樣緩沖液按照4∶1體積比混合，沸水變性10 min。以40 μg的各樣品總蛋白量進行電泳分離，轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。Ⅰ抗4 ℃孵育過夜后，加入Ⅱ抗孵育2 h。將ECL試劑中增強液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加至PVDF膜，反應2 min后進行顯影曝光，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，統(tǒng)計各組蛋白的相對表達量。

4　統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）形式表示。兩組間比較采用獨立樣本檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　bEnd.3細胞的形態(tài)學觀察

光學顯微鏡下觀察bEnd.3細胞形態(tài)，可見其呈梭形、長條形或三角形貼壁生長，呈鋪路石樣，形態(tài)飽滿、排列緊密，各組細胞肉眼觀察無明顯形態(tài)學改變。與control組相比，OGD組細胞排列分散、稀疏，細胞間隙擴大；HXDX含藥血清和Fer-1處理后，細胞間的連接有所改變，OGD+HXDX組顯得更為緊密，見圖1。

Figure 1.Morpholocical observation of bEnd.3 cells in each group （inverted optical microscope， scale bar=20 μm）.

2　HXDX含藥血清對細胞內鐵含量的影響

本研究采用FerroOrange熒光探針檢測細胞內Fe2+的含量變化。結果顯示，與control組相比，OGD組bEnd.3細胞內Fe2+熒光強度顯著增強（<0.05）；與OGD組相比，OGD+HXDX組和OGD+Fer-1組的熒光強度均顯著降低（<0.05），而Fer-1抑制鐵聚集的作用更為顯著（<0.05），見圖2。

Figure 2.The content of Fe2+ in bEnd.3 cells detected by FerroOrange probe （scale bar=50 μm）. Blue： Hoechst 33342 staining， indicating the nucleus. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs OGD group； &P<0.05 vs OGD+Fer-1 group.

3　DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS含量

與control組相比，OGD組bEnd.3細胞內ROS含量顯著增加（<0.05）；與OGD組相比，HXDX含藥血清和Fer-1均能抑制ROS的生成，OGD+HXDX組ROS水平顯著低于OGD+Fer-1組（<0.05），見圖3。

Figure 3.Flow cytometry detection of intracellular ROS content in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs OGD group； &P<0.05 vs OGD+Fer-1 group.

4　各組細胞SOD、MDA和GSH水平

與control組比較，OGD組bEnd.3細胞內SOD活性和GSH含量顯著下降，MDA含量顯著增高（<0.05）；與OGD組相比，OGD+HXDX組和OGD+Fer-1組SOD活性和GSH含量顯著升高（<0.05），HXDX含藥血清的作用最為顯著（<0.05），OGD+HXDX組和OGD+Fer-1組MDA水平均顯著降低（<0.05），但二者比較無顯著差異，見圖4。

Figure 4.Effect of Huoxue-Dingxuan capsule （HXDX） on oxidative stress indexes in each group. A： superoxide dismutase （SOD） activity； B： malondialdehyde （MDA） content； C： glutathione （GSH） content. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs model group； &P<0.05 vs OGD+Fer-1 group.

5　bEnd.3細胞內鐵死亡相關蛋白的表達情況

與control組比較，OGD組Nrf2蛋白表達有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（>0.05），FTH1和GPX4蛋白表達顯著降低（<0.05），ACSL4、COX2和NOX1蛋白表達顯著升高（<0.05）；與OGD相比，OGD+HXDX組Nrf2、FTH1和GPX4蛋白表達顯著增加（<0.05），COX2和NOX1蛋白表達顯著降低（<0.05）；OGD+HXDX組和OGD+Fer-1組ACSL4表達降低，但無顯著差異（>0.05），見圖5。

Figure 5.Effect of Huoxuedingxuancapsuleson ferroptosis related proteins expression ineach group. A：protein expression of Nrf2， FTH1 and GPX4 was detected by Western blot；B：Nrf2；C：FTH1；D：GPX4；E：protein expression of ACSL4， COX2 and NOX1 was detected by Western blot；F：ACSL4；G：COX2；H：NOX1. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs model group.

討論

頸椎退行性改變導致頸部動靜力失衡，椎動脈及交感神經遭受機械性刺激，造成椎-基底動脈血流減少、腦組織供血不足是CSA關鍵的病理因素［10］。中醫(yī)學認為CSA屬于“眩暈”、“頭痛”等范疇［10］，《靈樞·口衛(wèi)》曰：“上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴，頭為之苦傾，目為之?！?，氣血運行失調、血脈瘀滯不通、頭目清竅失養(yǎng)是其主要的病因病機。HXDX是甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院院內制劑，針對CSA氣虛血瘀的關鍵病機，選用具有甘肅地域特色的道地藥材組方，能有效緩解CSA的不適癥狀、降低復發(fā)率［11］。前期研究表明，HXDX通過對血管內皮細胞自噬與凋亡的調控以及清除過度生成的氧化自由基，從而減輕血管缺血狀態(tài)下的氧化應激損傷［6-7］。鐵死亡是一種鐵依賴性而導致細胞出現脂質過氧化的程序性細胞死亡形式，氧化應激和內源性的抗氧化失衡是導致細胞發(fā)生鐵死亡的關鍵因素［12］。而在缺血缺氧狀態(tài)下，大量Fe3+進入細胞內被還原成Fe2+，更容易觸發(fā)鐵死亡［13］。本研究旨在探究bEnd.3細胞在OGD處理后的鐵死亡情況及HXDX的干預效應。

鐵代謝紊亂和ROS大量聚集是細胞鐵死亡的特征性改變，本研究通過FerroOrange和DCFH-DA熒光探針檢測表明，OGD誘導后bEnd.3細胞內Fe2+和ROS水平顯著升高，說明OGD誘導會造成bEnd.3細胞內鐵過載和脂質過氧化產物ROS的產生。GPX4是抗氧化體系的核心調控酶，也是鐵死亡發(fā)生的標志蛋白［14］，經OGD處理后細胞內GPX4蛋白表達顯著降低，可基本確定OGD能誘導bEnd.3細胞鐵死亡。而氧化應激指標SOD、GSH及MDA測定結果顯示，OGD組SOD活性和GSH含量顯著下降，MDA含量顯著增高，初步證實OGD容易造成bEnd.3細胞氧化應激，導致抗氧化失衡，進而造成細胞鐵死亡。另外，利用Western blot技術對鐵死亡關鍵蛋白的檢測結果表明，OGD處理后FTH1表達顯著降低，ACSL4、NOX1及COX2顯著增高，進一步證實了bEnd.3細胞的鐵死亡。值得注意的是，Nrf2作為機體重要的抗氧化因子［15］，在細胞應激狀態(tài)下有所增高，屬于保護反應，但無顯著差異。

Fer-1是一種選擇性的鐵死亡抑制劑，可通過阻斷GSH的產生而發(fā)揮作用，在使用Fer-1和HXDX干預后，二者均可降低細胞內Fe2+、ROS與MDA含量，提高SOD活性和GSH表達，抑制OGD誘導的bEnd.3細胞鐵死亡，總體而言，HXDX含藥血清的作用更為明顯。HXDX含藥血清干預能顯著增高細胞Nrf2、FTH1和GPX4蛋白表達，降低COX2和NOX1蛋白水平，而ACSL4含量雖有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，說明HXDX含藥血清可能主要通過對Nrf2、FTH1、GPX4、COX2及NOX1蛋白表達的影響而抑制OGD誘導的bEnd.3細胞鐵死亡。

綜上所述，本研究從缺血缺氧條件下容易觸發(fā)血管內皮細胞鐵死亡的途徑探討了HXDX對這一病理損傷的調控作用，進一步揭示了HXDX可能通過對血管內皮細胞鐵死亡的抑制，減輕血管的氧化應激損傷，從而糾正血管內皮功能的紊亂。

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Effect of Huoxue-Dingxuan capsule-containing serum on ferroptosis of bEnd.3 cells induced by oxygen-glucose deprivation

WANG Kai1， SONG Min1，2△， SONG Zhi-jing1，2， LI Jin-yi1， FAN Kai1， HAI Yun-xiang1

（1，730000，；2，730020，）

To investigate the effect of Huoxue-Dingxuan capsule （HXDX） on the ferroptosis of mouse brain microvascular endothelial cell line bEnd.3 induced by oxygen-glucose deprivation （OGD）.The bEnd.3 cells were divided into control group， OGD group， OGD+ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 （Fer-1） group and OGD+HXDX group. The cells in control group were cultured normally， while those in other groups were subjected to OGD. The cells in OGD+Fer-1 group and OGD+HXDX group were treated with 1 μmol/L Fer-1 and 10% HXDX-containing serum， respectively， and treated with OGD for 6 h. FerroOrange and DCFH-DA probes were used to measure the levels of Fe2+and reactive oxygen species （ROS）， respectively， and the levels of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA） and glutathione （GSH） were measured by commercial kits. The protein levels of nuclear factor E2-related factor 2 （Nrf2）， ferritin heavy chain 1 （FTH1）， glutathione peroxidase 4 （GPX4）， long-chain acyl-CoA synthase 4 （ACSL4）， cyclooxygenase 2 （COX2） and NADPH oxidase 1 （NOX1） were detected by Western blot.Compared with control group， the Fe2+and ROS levels were significantly increased， SOD activity and GSH expression decreased， and MDA content increased significantly in OGD group （<0.05）. The expression of FTH1 and GPX4 was decreased， while the levels of ACSL4， COX2 and NOX1 were increased （<0.05）， and there was no significant difference in Nrf2. The Fe2+， ROS and MDA levels were significantly decreased， while SOD activity and GSH content were significantly increased after treatment with HXDX-containing serum （<0.05）. The expression of Nrf2， FTH1 and GPX4 were significantly increased （<0.05）， while COX2 and NOX1 were decreased （<0.05）， and there was no significant difference in ACSL4.Huoxue-Dingxuan capsule inhibits OGD-induced ferroptosis of bEnd.3 cells， which is related to reducing Fe2+and ROS levels， attenuating lipid peroxidation and regulating ferroptosis-related protein expression.

Cervical spondylosis of vertebral artery type； Huoxue-Dingxuan capsule； bEnd.3 cells； Oxygen-glucose deprivation； Ferroptosis

R743； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.03.005

1000-4718（2022）03-0420-07

2021-12-01

2022-02-12

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 81360554； No. 81760876）；甘肅省自然科學基金資助項目（No. 1610RJZA069）；甘肅省教育廳優(yōu)秀研究生“創(chuàng)新之星”項目（No. 2021CXZX-765）；甘肅省高等學?？茖W研究項目（No. 2017A-053）

Tel： 0931-5161526； E-mail： sm@gszy.edu.cn

（責任編輯：盧萍，羅森）